Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

A ionização por eletropulverização secundária, espectrometria de massa ou CS EMS permite a análise de voláteis bacterianos sem a necessidade de qualquer amostra. Pré-tratamento. O headspace da cultura bacteriana é deslocado pelo dióxido de carbono para a câmara de reação cssi. À medida que os voláteis atravessam a câmara de reação SSI, eles passam pela nuvem de eletrospray e se ionizam.

Uma vez ionizados, os voláteis são puxados para o espectrômetro de massa para análise. O excesso de gás transportador e os voláteis bacterianos não reativos são passados por um filtro de 0,22 mícron para remover quaisquer agentes bacterianos como uma medida adicional de ventilação de proteção para uma coifa química. Em última análise, este protocolo CSI MS oferece impressões digitais bacterianas voláteis em minutos.

Prevemos que essa tecnologia possa ser usada em muitas aplicações, incluindo expiração, análise de respiração para doenças infecciosas ou até mesmo aplicada a sistemas alimentares onde podemos detectar rapidamente patógenos que estão em nossos alimentos. Existem várias vantagens principais para esta técnica. Nos métodos existentes, como peneiramento GCMS, MS e PT, RM S primeiro, os voláteis não requerem nenhum pré-tratamento antes da análise.

Em segundo lugar, é possível fragmentar íons específicos na mistura volátil, o que facilita a identificação do composto. E terceiro, é rápido. Normalmente, leva menos de cinco minutos.

Para analisar cada amostra, escolha o recipiente apropriado para o cultivo de sua cultura, considerando os requisitos de crescimento da espécie, bem como a entrega eficiente de voláteis ao espectrômetro de massas. Nesta demonstração, selecionamos garrafas de mídia de pira padrão de 100 mililitros. Os voláteis bacterianos são entregues ao espectrômetro de massa por um fluxo de gás transportador para montar o transportador.

As linhas de gás encaixam os frascos de cultura com tampas rosqueadas que têm pelo menos duas portas de isca. Insira as linhas de entrada e saída de gás através das portas de isca e conecte quaisquer portas adicionais antes de cultivar suas amostras. Pressurize os vasos e mergulhe na água para verificar se há vazamentos.

Vazamentos de gás são a principal causa de resultados atípicos na forma de fracos ou ausentes. Os sinais de íons voláteis crescem durante a noite. Culturas de e coli, K 12 e pseudomonas aerogen, PAO uma em LB Lennox preparando duas repetições biológicas para cada espécie.

Prepare nove frascos de cultura estéreis contendo 50 mililitros de LB Lennox e um frasco não inoculado para ser usado como um inóculo em branco a cada cultura noturna em dois frascos de amostra. Criando réplicas técnicas, incubar as culturas e o branco por 24 horas a 37 graus Celsius. Como o CEMS é projetado especificamente para amostrar voláteis, limite o uso de produtos de higiene pessoal perfumados antes de usar o instrumento firmemente.

Tampe todos os produtos químicos voláteis no laboratório e controle as correntes de ar o máximo possível durante o teste para evitar a contaminação do seu instrumento e das linhas de transferência de gás. Com agentes biológicos viáveis, instale filtros do tamanho de poro apropriado na linha de gás de arraste. Os filtros não interferem na transferência de voláteis para a câmara de reação sesi, mas podem afetar ligeiramente a eficiência da transferência de aerossóis.

Para verificar se o voltage alimentação está desligada e se o sistema está descarregado de eletricidade, verifique as luzes indicadoras no voltage fornecedor desligado. Certifique-se de que o voltage no multímetro é zero e aterre os cabos elétricos. Neste momento, instale a solução de eletrospray para análise.

No modo de íon positivo, usamos uma solução de eletrospray de 0,1% de ácido fórmico, 5% de metanol e 94,9% de água Para obter a intensidade e estabilidade ideais do sinal, ligue o gás transportador de dióxido de carbono e defina a vazão para dois litros por minuto. Aplique pressão no reservatório de eletropulverização para iniciar a entrega da solução de eletropulverização à câmara de reação a uma vazão de cinco nanolitros por segundo. Em seguida, ligue a fonte de tensão e ajuste a tensão para 2,5 quilovolts.

A tensão aplicada afeta a intensidade do íon do sinal e a estabilidade do eletro spray Cone de alfaiate para o nosso sistema tensões entre dois e cinco quilovolts. Forneça os melhores resultados no exercício do modo de íon positivo Cuidado, pois neste ponto as superfícies metálicas da fonte de ionização são capazes de causar um choque perigoso. Agora configure um método de ajuste para monitorar o espectro SEMS.

Desmarque a caixa de seleção aquisição de vários canais ou MCA. Defina o tempo de aquisição para 10 a 15 minutos e inicie a aquisição de dados. Observar os espectros do fundo do gás portador e fazer ajustes finos na tensão aplicada para obter um cromatograma de iões totais estável e varrimentos reprodutíveis.

Continue a coletar espectros e um TIC por cinco minutos para garantir que o instrumento esteja estabilizado com o instrumento segurado. Insira os parâmetros de aquisição conforme apropriado para seu experimento. Registre um espectro de fundo de gás portador para experimentos futuros.

Para coletar um espectro em branco. Direcione o fluxo de gás de arraste através das linhas de desvio e, em seguida, conecte a amostra em branco com as válvulas fechadas às linhas de transferência do instrumento. Abra as válvulas do frasco de amostra e feche as válvulas das linhas de desvio.

Para espectros reprodutíveis. Deixar o sistema em equilíbrio durante 30 segundos, durante os quais a humidade na câmara de reacção se estabiliza. Para garantir que o sistema esteja equilibrado, monitore o TIC, que mudará durante o período de equilíbrio seguido de estabilização.

Uma vez que o sistema esteja equilibrado, inicie a coleta de espectro. Após a coleta do espectro, remova o frasco de amostra abrindo primeiro as linhas de desvio do gás portador. Em seguida, fechando as válvulas de amostra.

E, por último, removendo o frasco de amostra. Lave o sistema com o gás de arraste por dois a quatro minutos para remover a umidade e os voláteis absorvidos das linhas de transferência e evitar o transporte de amostra para amostra. Colete dados voláteis de impressões digitais para cada amostra bacteriana, coletando intermitentemente espectros em branco adicionais para garantir uma subtração completa do branco.

O modo de íon positivo impressões digitais voláteis para e coli e p aerogênio. Cultivado aeróbico em LB Lennox por 24 horas a 37 graus Celsius são distintos. O espectro volátil de E coli é dominado por indu com uma relação massa/carga de 118, enquanto o espectro de Pseudomonas aerogen contém uma variedade maior de picos de proteína adicionáveis.

Ao tentar este procedimento, é importante que você registre os parâmetros instrumentais que você otimizou para sua análise, como a tensão aplicada, a composição da solução de eletropulverização e a taxa de fluxo do gás de arraste. Também é importante que você mantenha registros de seus espectros representativos para que possa reproduzir suas análises no futuro. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas e alta voltagem pode ser extremamente perigoso.

Portanto, precauções como limitar o acesso ao css CMS durante o experimento devem sempre ser tomadas. Portanto, agora você deve ser capaz de obter de forma reprodutível um CSS, espectros EMS para os voláteis bacterianos em seu sistema. Boa sorte.