Name: Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a caracterizar compostos voláteis bacterianos usando SESI-MS sem pré-tratamento amostral. Esta técnica rápida detecta impressões digitais de voláteis em menos de cinco minutos para aplicações clínicas e de segurança alimentar.

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Este trabalho é financiado pelo NIH conceder RR021905 P20-01, CF conceder STANTO07R0 RPD, e conceder NASA NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema SESI-MS análise de voláteis bacteriana. O headspace da cultura bacteriana é deslocado pelo CO 2 (1) para a câmara de reação SESI (2). Como os voláteis atravessar a câmara de reação SESI eles passam através da nuvem electrospray e tornar-se ionizado (3). Uma vez ionizado, os voláteis são puxados para o espectrômetro de massa para análise (4). Transportadora de gás em excesso e não reagiu voláteis bacterianas são passados ​​através de um filtro de 0,22 mM (5), como uma medida adicional de proteção, e ventilado para um capuz químico. Detalhe: A agulha electrospray SESI é um capilar de sílica (40 ID mm) com uma ponta de agulha afiada. Como uma demonstração da utilização do SESI-MS para a caracterização de compostos voláteis bacteriana, E. coli K12 e P. PAO1 aeruginosa são cultivadas em aerobiose durante 24 h em 50 mL de Lennox-LB a 37 ° C e os espectros SESI-MS do headspace voláteis são coletados em dois minutos. De dióxido de carbono (99,99%) a uma vazão de 2 L / min é usado como gás de transporte para entrega volátil para a câmara de reação. A câmara de reação SESI era costume construída e preparada para uma API-3000 (SCIEX), substituindo a fonte de íons originais electrospray. Os espectros são recolhidos no modo íon positivo usando 0,1% de ácido fórmico, metanol 5,0%, e 94,9% de água (v / v) como a solução electrospray, entregue em 5 nL / s através de uma sílica não-condutor capilar com uma ponta de agulha afiada (40 ID mm). A tensão aplicada é de 2,5 kV. Analista de software 1.4.2 (Applied Biosystems) é usado para a coleta de dados com os seguintes parâmetros: 20 - 500 Da, MCA modo, 40 scans, 3 s / scan, e 2 min tempo de análise total. 1. Sistema de cultivo <ol><li> Escolha a embarcação apropriada para o cultivo de suas culturas, considerando as necessidades de crescimento da espécie em sua experiência (por exemplo, aeração, temperatura, luz, etc), bem como a prestação eficiente de voláteis para o espectrômetro de massa. As garrafas de cultura que escolhemos para uso são padrão de 100 ml frascos Pyrex mídia equipados com tampas de rosca que têm pelo menos duas portas luer. Uma linha de entrada é inserido através de uma porta luer para entrega transportadora de gás para o frasco da amostra e uma linha de saída é inserido através de outra porta para entrega de COV para o instrumento (Figura 1). Qualquer portas adicionais estão conectados. </li><li> Antes de cultivo das amostras, pressionar os vasos e submergir na água para verificar vazamentos. Fugas de gás são a principal causa de resultados atípicos na forma de sinais fracos ou ausentes ion volátil. </li></ol> 2. Experimento biológico: set-up e segurança considerações <ol><li> Crescer o seu culturas nas condições adequadas à sua hipótese. Recomenda-se que pelo menos dois biológicos repetições, cada uma com dois técnicos repetições, são usados ​​para cada variável. </li><li> Prepare um espaço em branco para cada condição de cultura (meio, antibióticos, etc) e incubar os em branco sob as mesmas condições que as suas amostras. </li><li> Empregar as precauções de segurança que são apropriadas para os agentes biológicos que você está usando, levando em consideração o nível de biossegurança (s) da espécie. </li><li> Para evitar a contaminação de seu instrumento e as linhas de gás de transferência com agentes biológicos viável, instale filtros do tamanho dos poros adequados para a linha de gás transportador. Os filtros não irão interferir com a transferência de compostos voláteis da câmara de reacção SESI, mas pode ser ligeiramente o impacto da eficiência da transferência de aerosol. 6 </li><li> Use de contenção secundária ou um armário de biossegurança ao anexar a tampa de transferência de gás para o frasco de cultura para assegurar a contenção adequada em caso de derramamento de agentes biológicos. </li><li> Iniciar e terminar o fluxo de gás portador a sua garrafa de amostra de uma forma que não vai aumentar a pressão dentro da garrafa. </li></ol> 3. Otimização de instrumento NOTA: SESI-MS é projetado especificamente para voláteis da amostra, para limitar o uso da fragrância itens de cuidados pessoais (por exemplo, colônias, anti-séptico bucal, loções, amaciante de roupa), goma, cigarros, etc antes de usar o instrumento. Firmemente cap todos os produtos químicos voláteis no laboratório e de controle aéreo rascunhos, tanto quanto possível durante o teste. Os seguintes parâmetros instrumentais, que afetam a intensidade do sinal e estabilidade, terá de ser otimizado para o seu instrumento e experiência. <ol><li> Solução electrospray e taxa de fluxo: Escolha a solução electrospray apropriado para a classe de moléculas que deseja atingir, tendo em conta a polaridade instrumento operacional (modo positivo ou negativo-ion) e de caráter molecular dos compostos-alvo. Neste experimento a solução electrospray é de 0,1% de ácido fórmico, metanol 5,0%, 94,9% de água (v / v), o que aumenta a intensidade do sinal de menos moléculas polares while proporcionar estabilidade bom sinal. A solução é entregue a uma vazão de 5 nL / s. </li><li> Caudal do gás: O caudal do gás pode afetar a estabilidade electrospray e da intensidade do sinal. CO 2 (≥ 99,99%) a uma vazão de 2 L / min é usado aqui. </li><li> Forma de agulha e posição: A forma ea posição ponta da agulha afetar fortemente a intensidade do sinal e estabilidade. Ao instalar uma nova agulha, a posição da agulha deve ser otimizada para criar um equilíbrio entre o fundo baixo, alto sinal do analito, e estabilidade de sinal. A fim de reproduzir os espectros SESI depois de uma mudança de agulha, é necessário recolher periodicamente espectros como você ajustar a posição da agulha até que esteja capaz de igualar o espectro observado para seus registros. A distância da ponta da agulha electrospray à massa orifício especificação será 1-5 mm. </li><li> Tensão aplicada: A voltagem que é aplicada ao sistema afeta a intensidade de íons de sinal e da estabilidade do Taylor electrospray cone. Além disso, a tensão ideal é dependente de sua solução de electrospray e a forma da ponta da agulha. No início de sua série de experimentos, determine a tensão que produz o espectro ideal e estabilidade de sinal para o seu sistema, e depois usar essa voltagem para todos os experimentos subseqüentes. Para o nosso sistema, tensões aplicadas de 2,0-5,0 kV fornecer intensidade de sinal ótima e estabilidade electrospray. Para este experimento 2,5 kV é usado. </li></ol> 4. Ligar e ajustar o SESI-MS para análise <ol><li> Começar por assegurar que a tensão de alimentação está desligada e que o sistema é descarregado de eletricidade. Faça isso: 1) assegurar o indicador sobre a tensão de alimentação estão desligados, 2) garantir a tensão no multímetro é zero, e 3) de aterramento os fios elétricos. </li><li> Instalar a solução electrospray apropriado para a sua experiência. </li><li> Ligar o gás de arraste e definir o fluxo para a taxa apropriada para a sua experiência. </li><li> Aplicar pressão ao reservatório electrospray para iniciar a entrega da solução electrospray para a câmara de reação. </li><li> Ligue a tensão de alimentação e ajustar a tensão para um valor apropriado para seus experimentos. </li></ol> NOTA: Neste ponto, as superfícies de metal da fonte de ionização são capazes de entregar um choque perigoso. Ter um grande cuidado quando se trabalha em torno do instrumento uma vez que a tensão de alimentação foi ligado. <ol start="6"><li> Estabelecer um método de ajuste para o monitoramento do espectro SESI-MS ao fazer aperfeiçoá-lo ajustes para a tensão aplicada. Use os parâmetros de aquisição que tem otimizado para o seu sistema e sua experiência. Desmarque a vários canais de Aquisição caixa de seleção (MCA) (se aplicável) de modo que cada varredura produz um espectro independente, definir o tempo de aquisição de 10-15 min, e iniciar a aquisição. Espectros do fundo de gás transportador deve agora ser observados. </li><li> Faça aperfeiçoá-lo ajustes para a tensão aplicada para obter um cromatograma de íons estáveis ​​total (TIC) e verifica reprodutível que correspondem a CO 2 scans de suas experiências anteriores. Uma vez que os ajustes de tensão têm sido feitos, continuam a coletar espectros e TIC por cinco minutos para garantir o instrumento está estabilizado. </li><li> Uma vez que a estabilidade é assegurada instrumental, configurar o método de aquisição, conforme apropriado para as suas amostras, ajustando o tempo de aquisição, intervalo de dados e seleção de MCA, conforme necessário. Coletar uma transportadora de gás espectro de fundo para seus registros. </li></ol> 5. Obtenção de uma impressão digital volátil de sua cultura bacteriana <ol><li> Para coletar um espectro branco, direcionar o fluxo gasoso através das linhas de bypass, e em seguida, anexar a amostra em branco (válvulas fechadas) para as linhas de gás de transferência do instrumento. </li><li> Abra as válvulas para o frasco da amostra, e fechar as válvulas das linhas de bypass. </li><li> Permitir que o sistema atinja o equilíbrio por 30 segundos, durante os quais a umidade na câmara de reação está se estabilizando. Este período de equilíbrio é essencial para a obtenção de espectros reprodutível. Para garantir que o sistema está equilibrado, você pode querer monitorar o TIC, o que vai mudar durante o período de equilíbrio, e estabilizar depois. </li><li> Uma vez que o sistema é equilibrado, iniciar a coleta do espectro. </li><li> Depois que o espectro é coletado, retire o frasco da amostra pela primeira abertura do transportador linhas de desvio de gás, em seguida, fechar as válvulas de amostra e, finalmente, retirar o frasco da amostra. Lavar o sistema com o gás de transporte para 2-4 min, retirando a umidade e voláteis adsorvidos partir das linhas de transmissão, prevenção de amostra para amostra transição. </li><li> Repita os passos de 5,2-5,5 para cada amostra bacteriana, intermitentemente coleta de espectros em branco adicionais para garantir a completa subtração em branco. Incompleta subtração em branco levará àaparecimento de picos química de fundo no seu espectro processados ​​que são comuns às técnicas de ionização à pressão atmosférica (por exemplo, os ftalatos, silicones, etc.) 9 </li><li> Ao recolher o seu espectro, assegurar que os sinais de íons não são superiores aos limites de detecção linear de seu instrumento, como determinado pelo TIC ea intensidade máxima de picos individuais. Íons exceder os limites superiores do detector o seu instrumento pode gerar picos de artefato que não são representativos da sua amostra. </li></ol> 6. Resultados representante Como exemplo dos espectros SESI-MS que pode ser obtido para voláteis de bactérias, as impressões digitais íon positivo o modo volátil para E. coli e P. aeruginosa cresceu aerobicamente em Lennox-LB por 24 horas a 37 ° C são mostradas (Fig. 2). O E. coli volátil espectro é dominado por indole em 118 = m / z, o que dá E. culturas coli seu odor característico, enquanto que o espectro de P. aeruginosa contém uma maior variedade de picos protonatable. Por favor note que as intensidades relativas dos picos no espectro voláteis são dependentes dos parâmetros instrumental descrito na Seção 3. Esses parâmetros devem ser rigorosamente controladas a partir de experimento para experimento, a fim de obter espectros reprodutível. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Blank-iões positivos subtraídos modo SESI-MS espectros (20 - 150 m / z). Da E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1 voláteis após 24 h de crescimento aeróbico em Lennox-LB a 37 ° C. Para mais detalhes sobre os picos observados nos espectros SESI, consulte Zhu, et al. 8.

<ol><li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases. Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX, , (1999).</li>
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<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li>
<li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+organic+compounds+in+foods%3A+A+five+year+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li>
<li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+meat+flavor%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Bactérias produzem diferentes combinações de compostos voláteis, que podem ser utilizados para identificação bacteriana 10-12 e avaliação do estado metabólico. O método SESI-MS descrito aqui fornece um meio de caracterizar rapidamente voláteis bacteriana (em dois minutos ou menos), sem qualquer preparação da amostra, gerando uma &quot;impressão digital&quot; bacteriana para a identificação da espécie. 8 Nas últimas décadas ionização a pressão atmosférica outros MS técnicas foram aplicadas para a caracterização de compostos voláteis, incluindo tubo de íon seletivo de fluxo (SIFT) e reação de prótons de transferência (PTR) espectrometria de massa. A vantagem distintiva que o SESI oferece mais esses métodos de ionização outro é que é possível a picos fragmento específico (desde que o tipo apropriado de espectrômetro de massa foi adaptada para o SESI), que é uma importante ferramenta para identificação de compostos. Nós não combater a fragmentação de pico no protocolo listados acima, mas exemplos de como informações de fragmentação pode ser utilizado na caracterização de compostos voláteis bacteriana, consulte Zhu, et al. 8 SESI-MS tem aplicação directa à situ na detecção de infecções bacterianas pulmonares através da análise da respiração, mas também pode ser aplicado a qualquer cenário em que a amostragem volátil é possível. Por exemplo, as análises de compostos voláteis na urina, sangue e respiração, que são relevantes para o diagnóstico de doenças metabólicas, doenças gastroenteric, câncer e exposição ambiental, estão bem adaptados ao SESI-MS. 13,14 SESI-MS também tem uma ampla gama de aplicações não clínicas fingerprinting VOC, incluindo a análise rápida de alimentos para os voláteis característica associada com o amadurecimento, o envelhecimento, ou estragar 15-18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> API-3000 Triplo Quadrupolo </td><td> Instrumento </td><td> SCIEX </td><td></td><td> Comprado com o Analista 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI Fonte Ion </td><td> Instrumento </td><td></td><td></td><td> Custom-made; referência Veja 6 </td></tr><tr><td> Medidor de fluxo de gás </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Gás carbônico </td><td> Equipamento </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99,99% puro </td></tr><tr><td> Nitrogênio </td><td> Equipamento </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Alta pureza Ultra </td></tr><tr><td> 100 mL de vidro de garrafas de mídia </td><td> Equipamento </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 roscas </td></tr><tr><td> Tampas de garrafa com portas luer </td><td> Equipamento </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Luer porta velas </td><td> Equipamento </td><td> Bio Chem Fluidics </td><td> 009LP </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Tubo 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap montagem e linhas de transferência de gás </td></tr><tr><td> Tubo 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Duas válvulas de sentido </td><td> Equipamento </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap montagem </td></tr><tr><td> Filtro, Grade AAQ </td><td> Equipamento </td><td> Filtros Balston </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico, LC / MS grau </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> A117-05AMP </td><td> Solução electrospray </td></tr><tr><td> Metanol, grau de LC / MS </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> A456-500 </td><td> Solução electrospray </td></tr><tr><td> Água, LC / MS grau </td><td> Reagente </td><td> Pescador </td><td> W6-500 </td><td> Solução electrospray </td></tr></tbody></table>

caracterizando voláteis bacteriana secundária usando ionização espectrometria de massa (sesi-ms)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) é um método desenvolvido para a rápida detecção de compostos voláteis, sem a necessidade de pré-tratamento da amostra. O método foi primeiramente descrita por Fenn e colaboradores 1 e tem sido aplicada para a detecção de drogas ilícitas 2 e explosivos 3-4, a caracterização de compostos voláteis de pele 5, ea análise de ar 6-7. SESI ionização ocorre por reações de transferência de prótons entre a solução eo analito electrospray volátil, e, portanto, adequado para a análise de hetero-moléculas orgânicas, assim como na ionização electrospray tradicionais (ESI). No entanto, ao contrário ESI padrão, o processo de transferência de prótons do SESI ocorre na fase vapor, em vez de em solução (Fig. 1), e, portanto, SESI é o mais adequado para a detecção de voláteis orgânicos e aerossóis. Estamos expandindo o uso do SESI-MS para a detecção de compostos voláteis de bactérias como um método para a identificação e caracterização de bactérias 8. Nós demonstramos que SESI-MS fingerprinting volátil, combinado com um método de análise estatística, pode ser usado para diferenciar gêneros de bactérias, espécies e culturas mistas em uma variedade de meios de crescimento. 8 Aqui nós fornecemos os passos para a obtenção de impressões digitais bacteriana voláteis usando SESI -MS, incluindo os parâmetros instrumentais que devem ser otimizados para garantir a identificação e caracterização de bactérias robusta.

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) permite a detecção de compostos orgânicos voláteis (VOCs) sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. Este protocolo fornece instruções para a caracterização (dentro de minutos) rápida de VOCs bacteriana usando SESI-MS.

Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

A espectrometria de massas com ionização por electrospray secundário (SESI-MS) é um método desenvolvido para a detecção rápida de compostos voláteis, sem a necessidade de...

A ionização secundária por pulverização eletrostática, espectrometria de massas ou CS EMS permite a análise de voláteis bacterianos sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. O espaço gasoso do cultivo bacteriano é deslocado por dióxido de carbono para dentro da câmara de reação CS SI. À medida que os compostos voláteis atravessam a câmara de reação SSI, passam pela nuvem de pulverização eletrostática e são ionizados.Uma vez ionizados, os voláteis são conduzidos ao espectrômetro de massas para análise. O excesso de gás de arraste e os voláteis bacterianos não reativos passam por um filtro de 0,22 mícron para remover qualquer agente bacteriano, como medida adicional de proteção, sendo então liberados para um capuz químico. Em última análise, este protocolo de EMS fornece perfis voláteis bacterianos em minutos.Prevê-se que esta tecnologia possa ser utilizada em diversas aplicações, incluindo a expiração, a análise do hálito para doenças infecciosas ou até em sistemas alimentares, onde poderíamos detectar rapidamente patógenos presentes nos alimentos. Existem várias vantagens principais nesta técnica em comparação com métodos existentes, como GCMS, espectrometria de massas e PT, RM S. Primeiramente, os compostos voláteis não requerem nenhum pré-tratamento antes da análise.Segundo, é possível fragmentar íons específicos na mistura volátil, o que facilita a identificação dos compostos. E terceiro, é rápido. Normalmente leva menos de cinco minutos.Para analisar cada amostra, escolha o recipiente apropriado para o crescimento do seu cultivo, considerando os requisitos de crescimento da espécie, bem como a entrega eficiente dos compostos voláteis ao espectrômetro de massas. Nesta demonstração, selecionamos frascos padrão de 100 mililitros para meio de cultura. Os voláteis bacterianos são conduzidos ao espectrômetro de massas por um fluxo de gás de arraste para montagem do sistema de transporte.As linhas de gás devem ser conectadas às garrafas de cultura com tampas rosqueáveis que possuam pelo menos duas entradas para conexões. Insira as linhas de entrada e saída de gás nas entradas, e tampe quaisquer entradas adicionais antes de iniciar o cultivo das suas amostras. Pressurize os recipientes e submerja-os em água para verificar vazamentos.Vazamentos de gás são uma causa primária de resultados atípicos na forma de sinais fracos ou ausentes. Os sinais iônicos voláteis aumentam durante a noite. Culturas de E. coli, K-12, e Pseudomonas aeruginosa, PAO1, em LB Lennox, preparando duas réplicas biológicas para cada espécie.Prepare nove frascos estéreis de cultura contendo 50 mililitros de LB Lennox e um frasco não inoculado para ser usado como branco; inocule cada cultura de incubação prolongada em dois frascos de amostra. Criando réplicas técnicas, incube as culturas e o branco por 24 horas a 37 graus Celsius. Como o CEMS é especificamente projetado para amostrar voláteis, limite o uso de produtos de cuidados pessoais perfumados antes de utilizar o instrumento com rigor.Tampe todos os produtos químicos voláteis no laboratório e controle ao máximo as correntes de ar durante os testes para evitar a contaminação do seu instrumento e das linhas de transferência de gás. Com agentes biológicos viáveis, instale filtros com o tamanho de poro apropriado na linha de gás de arraste. Os filtros não interferirão na transferência de compostos voláteis para a câmara de reação sesi, mas podem afetar ligeiramente a eficiência da transferência de aerossóis.Para verificar se a fonte de tensão está desligada e se o sistema está descarregado de eletricidade, verifique as luzes indicadoras na fonte de tensão desligada. Certifique-se de que a tensão no multímetro seja zero e aterre os cabos elétricos. Neste momento, instale a solução de eletrosspray para análise.No modo de íons positivos, utilizamos uma solução de eletrosspray contendo 0,1% de ácido fórmico, 5% de metanol e 94,9% de água. Para obter intensidade e estabilidade de sinal ideais, ligue o gás transportador de dióxido de carbono e ajuste a vazão para dois litros por minuto. Aplique pressão ao reservatório de eletrosspray para iniciar a entrega da solução de eletrosspray à câmara de reação a uma vazão de cinco nanolitros por segundo. Em seguida, ligue a fonte de tensão e ajuste a tensão para 2,5 quilovolts.A tensão aplicada afeta a intensidade do íon sinal e a estabilidade do cone de eletrosspray para as tensões do nosso sistema entre dois e cinco quilovolts. Oferecem os melhores resultados no modo de íons positivos. Exercite cautela, pois neste ponto as superfícies metálicas da fonte de ionização são capazes de causar um choque perigoso. Agora, configure um método de calibração para monitorar o espectro de SEMS.Desmarque a caixa de seleção de aquisição de múltiplos canais ou MCA. Defina o tempo de aquisição entre 10 e 15 minutos e inicie a aquisição de dados. Observe os espectros do fundo do gás de arraste e faça ajustes finos na tensão aplicada para obter um cromatograma de íons total estável e varreduras reprodutíveis.Continue a coletar espectros e A TIC por cinco minutos para garantir que o instrumento esteja estabilizado com o instrumento assegurado. Insira os parâmetros de aquisição conforme apropriado para o seu experimento. Registre um espectro de fundo do gás de arraste para experimentos futuros.Para coletar um espectro em branco. Direcione o fluxo do gás de arraste através das linhas de desvio e, em seguida, conecte a amostra em branco, com as válvulas fechadas, às linhas de transferência do instrumento. Abra as válvulas para o frasco da amostra e feche as válvulas das linhas de desvio.Para espectros reprodutíveis. Deixe o sistema equilibrar por 30 segundos, período durante o qual a umidade na câmara de reação estará se estabilizando. Para garantir que o sistema esteja equilibrado, monitore a TIC, que mudará durante o período de equilibração seguido por estabilização.Uma vez que o sistema esteja equilibrado, inicie a coleta do espectro. Após a coleta do espectro, remova o frasco da amostra abrindo primeiro as linhas de desvio do gás de arraste. Em seguida, feche as válvulas da amostra.E, por último, remova o frasco da amostra. Passe gás de arraste pelo sistema por dois a quatro minutos para remover a umidade e os voláteis absorvidos das linhas de transferência e evitar contaminação cruzada entre amostras. Colete dados do perfil volátil de cada amostra bacteriana, coletando intermitentemente espectros adicionais em branco para garantir uma subtração adequada do branco.Os perfis voláteis em modo de íons positivos para E. coli e P. aeruginosa, cultivados aerobiamente em caldo LB Lennox por 24 horas a 37 graus Celsius, são distintos. O espectro volátil de E. coli é dominado por um pico com razão massa/carga de 118, enquanto o espectro de Pseudomonas aeruginosa contém uma maior variedade de picos atribuíveis a proteínas.Ao realizar este procedimento, é importante que você registre os parâmetros instrumentais que otimizou para sua análise, como a tensão aplicada, a composição da solução de eletrosspray e a taxa de fluxo do gás de arraste. Também é importante manter registros de seus espectros representativos para que possa reproduzir suas análises no futuro. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias patogênicas e alta tensão pode ser extremamente perigoso.Portanto, precauções como limitar o acesso ao CSS CMS durante o experimento devem sempre ser tomadas. Agora você deverá ser capaz de obter de forma reprodutível um CSS e espectros EMS para os voláteis bacterianos em seu sistema. Boa sorte.

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Research

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