JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

وهناك طريقة لتغليف المسام المبيض والثقافة في نظام 3 تحلل Proteolytically الأبعاد

1, 2, 2,3,4, 1,4,5

1Institute for BioNanotechnology in Advanced Medicine, Northwestern University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Northwestern University, Feinberg School of Medicine, 3Center for Reproductive Research, Northwestern University, 4The Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University, 5Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Bioengineering. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.91.84.149, User IP: 54.91.84.149, User IP Hex: 911955093

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    وصفت طريقة جديدة لتغليف جريب مبيضي في شبكة الليفين - 3D ألجينات الإختراق. هذا النظام يجمع بين الدعم الهيكلي مع تدهور بروتين لدعم التنمية في بصيلات غير ناضجة لانتاج البويضات الناضجة. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لخلية المجاميع الثقافة للحفاظ على الخلية خلية الاتصالات دون الحد من التوسع.

    Date Published: 3/15/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2695

    Cite this Article

    Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System. J. Vis. Exp. (49), e2695, doi:10.3791/2695 (2011).

    Abstract

    جراب المبيض هو الوحدة الفنية للالمبيض التي تفرز الهرمونات الجنسية وتدعم نضوج البويضة في المختبر تقنيات جريب توفير أداة لتطوير نموذج جريب من أجل التحقيق في البيولوجيا الأساسية ، وكذلك يجري تطويرها كأسلوب للحفاظ على الخصوبة في عيادة 1-4. ثقافتنا المختبر في النظام يعمل الهلاميات المائية من أجل محاكاة البيئة الأصلية المبيض عن طريق الحفاظ على العمارة الجريبي 3D ، خلية خلية التفاعلات ويشير هذا التطور نظير الصماوي جريب المباشر 5. سابقا ، كانت تربيتها بنجاح في بصيلات الجينات ، وهو خامل الطحالب المستمدة من السكاريد أن يخضع تهليم مع أيونات الكالسيوم 6-8. والهلاميات المائية ألجينات شكلت في تركيز 0.25 ٪ ث / ت الأكثر تساهلا للثقافة جريب ، والإبقاء على أعلى كفاءة التنموية 9. ألجينات الهلاميات المائية ليست قابلة للتحلل ، وبالتالي زيادة في النتائج قطرها جريب في قوة ضاغطة على المسام التي يمكن أن تؤثر نمو بصيلات 10. بعد ذلك قمنا بتطوير نظام ثقافة تستند على شبكة الليفين - ألجينات الإختراق (FA - IPN) ، والتي هي خليط من تبلور الليفين والجينات في وقت واحد. هذا المزيج يوفر بيئة حيوية لأن كلا من مكونات ميكانيكية تساهم في مصفوفة الصلابة في البداية ، ولكن البروتياز التي يفرزها جريب تزايد تدهور الليفين في المصفوفة ترك الجينات فقط لتقديم الدعم. مع IPN ، يمكن خفض محتوى ألجينات أدناه 0.25 ٪ ، وهو غير ممكن مع الجينات وحدها 5. وهكذا ، كما توسع المسام ، وسوف تواجه قوة ضاغطة بسبب انخفاض لمحتوى المواد الصلبة مخفضة. هنا ، نحن تصف طريقة التغليف والثقافة في المختبر نظام لجريبات المبيض داخل FA - IPN. البيئة الحيوية الميكانيكية يحاكي البيئة الطبيعية في المبيض الذي المسام الصغيرة الموجودة في القشرة الصلبة والانتقال إلى لب أكثر تساهلا لأنها تزيد في حجم 11. قد يكون العنصر الحاسم للتحلل ولا سيما بالنسبة للترجمة السريرية من أجل دعم أكبر من 10 6 أضعاف الزيادة في حجم المسام التي تخضع عادة الإنسان في الجسم الحي.

    Protocol

    1. جريب العزل

    وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي أنشئت استخدام الحيوان المؤسسية وبروتوكول العناية في جامعة نورث وسترن.

    لأفضل النتائج ، يتم تنفيذ جميع التشريح في L15 سائل الإعلام من أجل السيطرة على مستويات الحموضة المحيط من ثاني أكسيد الكربون 2 ، 37 درجة مئوية على مراحل ساخنة للتحكم بدرجة الحرارة ، وعلى مقاعد البدلاء النظيفة للحد من التلوث الجرثومي. وسائل الإعلام مستعدة تشريح (DM) مع وسائل الاعلام L15 تستكمل مع البنسلين وحدة دولية / مل 50 و 50 ميكرولتر الستربتوميسين / مل و 1 ٪ FBS. وسائل الإعلام مستعدة الصيانة (MM) مع وسائل الاعلام αMEM تستكمل مع البنسلين وحدة دولية / مل 50 و 50 ميكرولتر الستربتوميسين / مل و 1 ٪ FBS.

    1. نقل المبيضين تشريح طازجة من العمر 16 يوما الماوس الى 35 ملم جديدة طبق بتري مع MM 1-2 مل تحتوي على 0.1 ٪ و كولاجيناز الدناز 0.1 ٪. احتضان لمدة 15 دقيقة داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
    2. بعد مرور فترة الحضانة ، تنفيذ عدة خطوات الغسيل في بلدية دبي لإزالة كولاجيناز ، ومن ثم نقلها إلى طبق بتري 35 ملم مع بلدية جديدة. عزل الحويصلات من المبيض عن طريق التحريك بلطف (أو القطع) بصيلات بعيدا من المبيض بالكامل باستخدام إبرتين قياس 28 08/05 المرفقة المحاقن. كما سدى إزالة أكبر قدر ممكن من دون الإضرار بسلامة المسام. تشريح من بصيلات الثانوية 20-40 في المبيض (130 - 150mm). وعادة ما يكون هؤلاء بصيلات 2-3 طبقات من الخلايا الجسدية.
    3. إضافة 1 مل MM إلى وسط جيد لأطفال الأنابيب 60 ملم (في الإخصاب) طبق بيتري ، و 3 مل MM الى الحلبة الخارجي. نقل بصيلات سليمة مع ماصة للالطوق الخارجي للطبق التلقيح الاصطناعي لشطف لفترة وجيزة ، ثم نقل انتقائي لهم في البئر المركزي (انظر 1.4). تخزين هذا الطبق في حاضنة أطفال الأنابيب.
    4. بعد أن يتم جمع كل المسام ، يتم تنفيذ الخطوة التحديد تحت المجهر تشريح مع التكبير 5 - 8X. بصيلات صحية لديهم الصفات التالية الصرفي :
      • 2-3 طبقات الخلية الجسدية
      • 130-150 ملم
      • لا يوجد فصل بين البويضة والخلايا الجسدية
      • جولة سليمة والبويضات
        نقل بصيلات صحي في مركز التلقيح الاصطناعي للأطباق التغليف.

    2. تغليف جريب ، أسلوب 1 -- "أسلوب إسقاط"

    1. إضافة 1 مل من 50 وحدة دولية / مل في ثرومبين TBS مع 40 ملم CaCl 2 في وسط الطبق جيدا التلقيح الاصطناعي. ذوبان الجليد والحفاظ على المخزون الفيبرينوجين (50 ملغ / مل في TBS) على الجليد. جلب الفيبرينوجين إلى درجة حرارة الغرفة الحق قبل الاستخدام.
    2. إعداد الحل الفيبرينوجين / الجينات التي 1X PBS الاختلاط ، ألجينات 0.5 ٪ في حل برنامج تلفزيوني و 50 ملغ / مل حل الفبرينوجين بنسبة 2:01:01 في أنبوب 1.7 مل microcentrifuge العقيمة. تجنب إدخال فقاعات في الحل. وتدور الدوامة برفق إلى أسفل. الحل يبدو غائما قليلا ، وينبغي أن نكون مستعدين على الفور قبل استخدامه.
    3. مكان اثنين من قطرات الفيبرينوجين / حل الجينات في الطوق الخارجي للصحن IVF : قطرة 90 ميكرولتر لتغليف وقطرة 10 ميكرولتر للغسيل. لتقليل التبخر ، وإيقاف مرحلة التسخين على مجهر تشريح. نقل بصيلات 10-15 في 10 ميكرولتر قطيرة مع الحد الأدنى من وسائل الإعلام الثقافة (<5 ميكرولتر) باستخدام micropipette 200 ميكرومتر الطرف ، والمزيج بسرعة. نقل كل من بصيلات الحبرية في 90 ميكرولتر مع الحد الأدنى من الحل (<5 ميكرولتر) من القائمة المنسدلة الأولى ، والمزيج.
    4. نضح احد ، أحد جريب و 5 ميكرولتر من الفيبرينوجين / ألجينات حل باستخدام غيض 10 ميكرولتر ماصة ، وإطلاقها في حل + ثرومبين / كا 2 في صحن التلقيح الاصطناعي. كرر هذه الخطوة حتى يتم تغليف كل المسام.
    5. عبر ربط حبات لمدة 5-7 دقائق في حل + ثرومبين / كا 2. وسوف تصبح أكثر قتامة من الخرز والمواد الهلامية الليفين. نقل الى MM الخرز طبق بتري تحتوي ، بدءا من قتامة الخرز الأولى. الطبق لاحتضان 15-30 دقيقة inthe حاضنة لشطف قبالة ثرومبين المتبقية.
    6. نقل إلى لوحة الخرز 96 ثقافة جيدة تحتوي على 100 ميكرولتر من وسائط النمو جريب ، والصورة على الفور. وسائل الإعلام مستعدة النمو (GM) مع وسائل الاعلام αMEM تستكمل مع 10 ميكرو وحدة / مل من FSH المؤتلف ، 3 ملغ / مل من جيش صرب البوسنة ، 1 ملغ / مل من فتوين البقري ، 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين ، 5 ميكروغرام / مل من ترانسفيرين ، و 5 نانوغرام / مل من السيلينيوم.

    3. تغليف جريب ، الأسلوب 2 -- "أسلوب Parafilm"

    1. إعداد الحل الفيبرينوجين / الجينات عن طريق خلط 0.5 ٪ حل الجينات و 50 ملغ / مل حل الفبرينوجين بنسبة 1:1 في أنبوب 1.7 مل microcentrifuge العقيمة.
    2. ماصة 7.5 ميكرولتر قطرات من خليط الفيبرينوجين / ألجينات على زجاج parafilm الشريحة المغلفة مع الفواصل 3 مم. 1 جريب نقل إلى كل قطرة مع الدنيامقدار لتر من وسائل الإعلام.
    3. إضافة 7.5 ميكرولتر من محلول + ثرومبين / كا 2 إلى كل قطرة. خلط غير ضروري لأن جل أشكال الفور تقريبا.
    4. تغطية المواد الهلامية مع الشريحة parafilm الزجاج المطلي الثانية ، وضعت الشرائح رأسا على عقب في طبق بتري 100 ملم ، ونقلها إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق.
    5. نقل الخرز في طبق بتري تحتوي MM ، ومن ثم الى ثقافة جيدا كما هو موضح سابقا. إذا كانت حبات العصا معا ، والتي من المقرر أن عبر ربط بين الخرز ، يمكن انهما انفصلا بلطف مع ملقط.

    4. التصوير جراب وتغير وسائل الإعلام

    1. كل يوم 2 ، يتم تصوير المسام مثقف باستخدام مجهر الضوء ويتم قياس قطرها جريب مع برنامج ImageJ البرنامج.
    2. كل يوم 2 ، يتم استبدال نصف وسائط النمو (50 ميكرولتر) من جديد ، وسائط النمو قبل معايرتها.

    5. استعادة جريب من مصفوفة 3D ونضوج في المختبر سيت (IVM)

    1. بعد 8 أيام من الثقافة ، والهلاميات المائية تظهر واضحة بسبب التدهور الشامل للعنصر الليفين ، وتوسيع المسام ليبلغ قطرها 300-400 ميكرون. والجينات المتبقية هي التي تدهورت بسبب الجينات ، ياز ، وهو الانزيم المشتقة من النباتات التي تحط على وجه التحديد والجينات لا تؤثر على الخلايا الحيوانية.
    2. إزالة وسائط النمو من الآبار التي تحتوي على الخرز وإضافة 100 مل من 10 وحدة دولية / مل ياز ألجينات في αMEM. إجازة لوحة في الحاضنة لمدة 25-30 دقيقة.
    3. إزالة بصيلات من الخرز الذائبة مع طرف نهاية حادة. نقل أولا إلى الطوق الخارجي للصحن يحتوي على التلقيح الاصطناعي للبلدية ، ومن ثم في مركز جيد ، يتضمن أيضا مارك ألماني لغسل.
    4. بعد الغسيل ، ونقل إلى بصيلات الخارجي ، والحلقة الداخلية من ثم طبق يحتوي على وسائل الاعلام IVF النضج. نضوج المختبر وفي وسائل الإعلام (IVM) تتألف من αMEM ، FCS 10 ٪ ، 1.5 وحدة دولية / مل من قوات حرس السواحل الهايتية ، و 5 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF)
    5. نقل إلى CO 2 حاضنة لل15-16 ساعة.
      دراسة للتوسع المسام الخلايا الركامية. لإزالة الركام من خلايا البويضة ، إضافة إلى تركيز هيالورونيداز حل نهائي 0،1 ملغ / مل واحتضان في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق. استخدام micropipette 75 ملم تلميح إلى الخلايا الركامية في القص من البويضة بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. تحديد مرحلة نضج البويضة تحت المجهر الخفيفة أو تشريح. المراحل الممكنة ، من الأقل إلى الأكثر نضجا ، هي :
      • تدهورت. تم تجزئة البويضة إلى قسمين أو أكثر من قطعة.
      • جرثومي حويصلة (GV) المرحلة. لم يتم استئناف البويضة الانقسام المنصف ردا على تعرض قوات حرس السواحل الهايتية ، وهو ما يتضح من استمرار وجود نواة البويضة (GV).
      • جرثومي انهيار حويصلة (GVBD). الغشاء النووي غائبة عن البويضة ، ولكن ليس هناك القطبية الحالية الجسم. لذلك ، لا يزال في بويضة الانقسام الاختزالي الأول.
      • الطورية الثاني اعتقلت البويضة (MII). استأنفت بويضة الانقسام الاختزالي ، ويتم القبض عليه الآن في الطورية الثاني. وينبغي أن يكون الجسم القطبية تكون مرئية على ضوء أو مجهر تشريح. وسوف تبقى البويضة المخصبة في صناعة المعلومات إلا في تجارب لاحقة.

    6. ممثل النتائج :

    صفنا طريقة التغليف رواية جريبات المبيض في FA - IPN للثقافة في المختبر (الشكل 1). جريبات المبيض تتكون من بويضة محاطة عدة طبقات من الخلايا الجسدية. التواصل بين مقصورات الخلوية متعددة أمر ضروري للتنمية الصحية وجريب نضوج البويضة. جريب التغليف في هيدروجيل 3D تؤيد توسيع المسام مع الحفاظ على بنية المسام 9،11،12. كما بصيلات تطوير وتوسيع حجمها أضعافا مضاعفة وبيولوجية التغليف ينبغي أن يسمح هذا التوسع دون تطوير قوة ضاغطة تمنع. FA - IPN هو عبارة عن شبكة مبنية من اثنين من المواد الطبيعية ، حيث يتم تحلل الفيبرين proteolytically بواسطة بلازمين تفعيلها من خلال المسام وبيولوجيا الجينات خاملة 13 (الشكل 2). أثناء نمو الجريب ، الليفين تدهور يبدأ محليا بالقرب من المسام ، وتستمر حتى يتم مسح الليفين من هيدروجيل. المكون ألجينات غير القابلة للتحلل ، والتي لا تزال على حالها طوال فترة والثقافة ، ويدعم هيكل 3D من هيدروجيل.

    وقد تم عزل بصيلات في المرحلة الثانوية للتنمية (150-180 قطرها ميكرون) ، وتوسعت إلى 400 ميكرومتر في المرحلة غاري التنمية في المواد الهلامية FA - IPN. التحفيز مع قوات حرس السواحل الهايتية ، لا يمكن للمثقف بصيلات الخضوع قزع توسيع الخلية ، ويمكن استئناف البويضات الانقسام الاختزالي والتقدم الثاني الطورية للإخصاب. هذه النتائج تشير إلى أن طريقة التغليف والمواد التغليف يسمح جريب الثقافة والنضج ناجحة في المختبر (الشكل 3).

    الليفين حول تدهور encapsulبصيلات ated يبدأ في اليوم الأول للثقافة ويكتمل بحلول يوم 6. ويمكن استخدام أبروتينين ، مثبط بلازمين القابلة للذوبان ، لتغيير الليفين التدهور والانحدار لتمديد الميكانيكية في مواد التغليف (الشكل 4). إذا كنت مثقف بصيلات مع 0.01 TIU / أبروتينين مل ، والليفين أبطأ المتدهورة للأيام ال 4 الأولى. ومع ذلك ، يمكن أن تتطور المسام لا يزال في مرحلة غاري وتبقى البويضات المختصة لاستئناف الانقسام الاختزالي الثاني الطورية بعد أبروتينين removed.A هو تركيز عال من أبروتينين (0.1 TIU / مل) بشكل كبير يحول دون تدهور الليفين ، مصفوفة الصلابة يمنع توسيع المسام والخلايا الجسدية لوحظ في مصفوفة الغزو.

    الشكل 1
    الشكل 1. انسيابي للتنمية جريب ، والجريب المبيض يتكون من بويضة في موقع مركزي تحيط به واحد أو أكثر من طبقات من الخلايا الجسدية ، والتي تدعم التنمية البويضة. كما وضع جراب من الثانوية إلى المرحلة غاري سابق للإباضة ، والخلايا الجسمية المحيطة البويضة تتكاثر والتفريق ، والزيادات في حجم البويضة. نضوج في المختبر (IVM) هو الخطوة النهائية للثقافة جريب ، عندما الخلايا الجسمية المتاخمة لل البويضة ، ووصف الخلايا الركامية ، وتوسيع قوات حرس السواحل الهايتية بعد التحفيز ، والبويضة يستأنف الانقسام الاختزالي ويتقدم إلى الثاني الطورية (MII) المرحلة.

    الشكل 2A
    الشكل 2A. الجينات والجينات ، الليفين للثقافة جريب 3D في المختبر (أ) هي مادة بيولوجية الجيني الطبيعي الذي هو مناسبة للثقافة في جراب المختبر بسبب تهليم لطيف والخصائص الكيميائية الحيوية ، مثل حجم فتحات الشباك ، وهمود جمود السيطرة البيولوجية. الجينات هي كوبوليمر السكاريد خطية من حمض α - L - guluronic (G) وβ - D - mannuronic حمض (M). المناطق مع مونومرات G تكرار ، ووصف "G - كتل" ، وعبر ربط لتشكيل هيدروجيل في وجود أيونات الكالسيوم ثنائي التكافؤ.

    الرقم 2B
    الرقم 2B (ثنائية) مغلفة المسام الصغيرة تجربة قوة الضغط المنخفض في الجينات في بداية الثقافة. لكن ، وكما المسام يوسع حجم حبة النازحين في تزايد ، والذي ينتج قوة أكبر ضاغطة في الاتجاه المعاكس للتوسع المسام (ب - II).

    الشكل 2C
    الشكل 2C ، وسلاسل من البوليمرات الفردية في شباكها تماما في حل الليفين - ألجينات قبل لربط المتبادل. كلا مكونات FA - IPN تبدأ على الفور عبر الارتباط كما يتعرضون لمزيج من ثرومبين والكالسيوم.

    الشكل 3A
    3A الرقم. معزولون انسيابي لعزل المسام والتغليف في المسام. FA - IPN الثانوية من ماوس لمدة 16 يوما من العمر (منظمة العفو الدولية). يتم تشريح الجهاز التناسلي (A - II) ، ويتم نقل بصيلات معزولة إلى طبق مع وسائل الاعلام الصيانة (A - III).

    الرقم 3B
    3B الرقم انخفاضا عن أسلوب التغليف جريب في حل ألجينات الفيبرينوجين (B : I - IV). قطرتين من الفيبرينوجين ، ألجينات الحل ، وانخفاض pipetted الشطف (10 ميكرولتر) وانخفاض التغليف (90 ميكرولتر) في صحن (BI). يتم نقل بصيلات القادم 05/03 إلى انخفاض الشطف (B - II). بعد الشطف وإزالة وسائل الإعلام ، يتم نقل بصيلات إلى الانخفاض التغليف (B - III). ويستنشق كل جريب حل مع 5 - الفيبرينوجين ألجينات ميكرولتر مع طرف 10 ميكرولتر ماصة ثم طرد الى ثرومبين / الكالسيوم الحل (B - IV).

    الرقم 3C
    الرقم 3C. crosslinks وحبة لمدة 5 دقائق. طريقة لتغليف parafilm جريب في حل ألجينات الفيبرينوجين (C : I - III). هو pipetted الفيبرينوجين - ألجينات حل (7.5 ميكرولتر) على زجاج parafilm الشريحة المغلفة ويتم نقل بصيلات فردي لكل قطرة بعد الشطف (CI ، والثاني). يضاف ثرومبين حل (7.5 ميكرولتر) إلى كل قطرة (C - III).

    الرقم 3D الإلكتروني
    وتغطي ه ويسقط مع شريحة parafilm الزجاج المطلي الثاني وcrosslinked على FA - IPN في الحاضنة لمدة 5 دقائق -- الرقم 3D. (د) يتم نقلها إلى وسائل الإعلام بصيلات مغلفة النمو في لوحة 96 - جيدا. (E) صورة من جريب مغلفة في FA - IPN (أبيض السهم).

    الشكل 4
    الشكل 4. الليفين التدهور المتزايد من قبل فوليكلي. بصيلات تتحلل المكون من الليفين FA - IPN خلال الفترة الثقافة ، وهو الأمر الذي اتضح من دائرة واضحة حول المسام. ويدعم بنية المسام في 3D من الجينات المتبقية. في اليوم 0 (D0) والليفين لا تزال سليمة ومصفوفة حول جريب غائما ، وبعد يوم 1 في الثقافة (D1) حلقة واضحة حول جريب يظهر (السهم الأبيض) والجبهة تدهور الليفين تواصل توسيع شعاعيا في اليوم 2 (D2) ويوم 4 (D4) للثقافة.

    الشكل 5
    الشكل 5. صور لنمو الجريب. الممثل الصور نمو بصيلات ofsecondary في FA - IPN يوم 0 (A) و 4 (ب) و 6 (ج) و 8 (د) من الثقافة. بعد 8 أيام ، ونضجت في المختبر الجريبات الغارية ، وتظهر في مرحلة صناعة المعلومات الناتجة البويضات (E ، يظهر الجسم القطبي مع السهم الأسود).

    الشكل 6
    الشكل 6. وكان يحول دون تدهور الليفين التي أبروتينين. تظهر تزايد بصيلات يوم 2 و 4 و 10 و 12 في الصف الأول. أبروتينين بتركيزات 0.01 أضيف TIU / مل (الصف الثاني) و 0.1 TIU / مل لوسائل الإعلام على الثقافة أيام 0 ، 2 ، و 4. فقط جريب الثقافات مع 0.01 الليفين TIU / مل أبروتينين المتدهورة بعد إزالة أبروتينين وصلت مرحلة غاري. بصيلات مثقف في 0.1 TIU / مل لم أبروتينين لا تنمو في FA - IPN.

    الاختصار بدر تام
    CO 2 الحاضنة 37 درجة مئوية مع حاضنة 5 ٪ CO 2
    COC قزع البويضة المعقدة
    3D الأبعاد 3
    DM تشريح وسائل الإعلام
    EGF عامل نمو البشرة
    FA - IPN الليفين - ألجينات شبكة الإختراق
    FBS المصل البقري الجنين
    جنرال موتورز نمو وسائل الإعلام
    GV حويصلة منتشة
    قوات حرس السواحل الهايتية الإنسان gonadotropin المشيمي
    ITS تكملة الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم
    IVF الطبق 60 ملم مركز جيد في طبق التلقيح الصناعي
    MM صيانة وسائل الإعلام
    MII مرحلة البويضة الطورية البويضة المرحلة الثانية
    rFSH المؤتلف هرمون تحفيز الجرابي
    TBS تريس مخزنة المالحة
    TIU وحدات التربسين المثبطة

    الجدول 1. المختصرات

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    جراب المبيض قدم طريقة التغليف في FA - IPN يسمح الثقافة جريب في بيئة 3D في المختبر. FA - A IPN هي عملية ديناميكية وتستجيب للخلية في المصفوفة التي تحدد الخصائص الميكانيكية الأولية عن طريق الجمع بين كل من الليفين والجينات. خلال الثقافة ، وتنشيط بصيلات مغلفة البروتياز التي تحط من مكون واحد فقط من IPN ، والليفين ، مما يؤدي الى تناقص تدريجي جمود هلام التي ساهمت فقط من الجينات المتبقية في نهاية الثقافة. وقد اقترحت الخصائص الميكانيكية الحيوية التي تم الحصول عليها مع FA - IPN لتكون متوافقة مع البيئة الطبيعية لبصيلات النامية وساهم في تحسن معدل نضوج البويضة الانتصافي مقارنة الجينات وحدها.

    ويوضح FA - IPN تهليم خفيفة وسريعة ، مع كل عنصر من عناصر النظام عبر ربط بواسطة آلية مستقلة. وقد وصفت لنا في مكان آخر (5) التي يمكن التحكم في سرعة تشكيل هلام بواسطة الفيبرينوجين وتركيزات ثرومبين. ويمكن تعديل معدل التدهور عن طريق تثبيط أبروتينين من التحلل البروتيني الليفين. وعادة ما يتم تربيتها لبصيلات الثانوية الفئران 8-12 أيام ، والأنواع الأخرى من بصيلات تتطلب فترات أطول الثقافة. وبالتالي ، يمكن تأخير تدهور الليفين التي يحتمل أبروتينين توفير بيئة ديناميكية لمدد أطول الثقافات.

    ويمكن تطبيق أساليب التغليف ووصف لأنظمة أخرى ، مثل التغليف وثقافة الصغيرة الأنسجة أو الهيئات مضغي الشكل ، والتي يمكن الاحتفاظ بها خلية خلية الاتصال بعد الكلي يمكن أن تتحلل جزئيا المصفوفة وخلق مساحة للتوسع. في الختام ، وطريقة التغليف FA - IPN يقدم ثقافة هيدروجيل العقيمة مع نظام ديناميكي خصائص الخلايا التي تستجيب والميكانيكية ومعدل التدهور يمكن السيطرة عليها.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (وU54HD41857 PL1EB008542 والحيوية الأساسية P30 ضمن منحة اتحاد Oncofertility خارطة الطريق).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fetuin Sigma-Aldrich F3385
    FBS Invitrogen 10082-139
    Aprotinin Roche Group 10236624001
    CaCl2 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 039-00475 40 mM
    EGF Sigma-Aldrich A412
    rFSH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
    hCG Sigma-Aldrich CG-5
    Hyaluronidase Sigma-Aldrich A1603
    ITS Sigma-Aldrich I1884-1VL
    L-15 GIBCO, by Life Technologies 11415
    αMEM+Gluta MAX GIBCO, by Life Technologies 32561
    Pen-Strep Cellgro 30-002-CI
    TBS Pierce, Thermo Scientific 28379
    Tisseel Fibrin kit Baxter Internationl Inc. 921030
    Sodium Alginate FMC BioPolymers LF200DL Mw 418kDa

    References

    1. Cortvrindt, R., Smitz, J. & VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction 11, 2656-2666 (1996).
    2. Smitz, J., Cortvrindt, R. & Hu, Y. X. Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture. Human Reproduction 13, 664-669 (1998).
    3. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K. & Shea, L. D. Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles. Biotechnology and Bioengineering 103, 378-386, doi:10.1002/bit.22250 (2009).
    4. Smitz, J.et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Human Reproduction Update 16, 395-414, doi:10.1093/humupd/dmp056 (2010).
    5. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K. & Shea, L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials 30, 5476-5485, doi:10.1016/j.biomaterials.2009.06.054 (2009).
    6. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K. & Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials 28, 4439-4448, doi:10.1016/j.biomaterials.2007.07.001 (2007).
    7. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K. & Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biology of Reproduction 73, 942-950, doi:10.1095/biolreprod.105.042390 (2005).
    8. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D. & Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering 9, 1013-1021 (2003).
    9. Xu, M., West, E., Shea, L. D. & Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biology of Reproduction 75, 916-923, doi:10.1095/biolreprod.106.054833 (2006).
    10. Xu, M.et al. Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles. Biology of Reproduction 81, 587-594, doi:10.1095/biolreprod.108.074732 (2009).
    11. West, E. R., Shea, L. D. & Woodruff, T. K. Engineering the follicle micro environment. Seminars in Reproductive Medicine 25, 287-299, doi:10.1055/s-2007-980222 (2007).
    12. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D. & Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Engineering 12, 2739-2746 (2006).
    13. Ebisch, I. M. W.et al. Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility. Fertility and Sterility 90, 2340-2350, doi:10.1016/j.fertnstert.2007.10.026 (2008).

    Comments

    6 Comments

    i want the protocol.
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 4, 2012, 3:16 AM

    Hello! Thank you for your comment. You can find a detailed protocol in the PDF file version of this publication. However, if you are interested in additional specific details you can email me directly at
    a-shikanov@northwestern.edu. Thanks!
    Reply

    Posted by: Ariella S.February 5, 2012, 9:27 AM

    hi, where can i find the pdf version? pubmed only shows the video reference. Thanks!
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 10, 2012, 9:41 AM

    Hello! You can contact me directly at ariellashikanov@gmail.com and I will be happy to send the protocol. Best,
    Ariella
    Reply

    Posted by: Ariella S.April 10, 2012, 12:43 PM

    hello
    please give me information and protocol for using fibrin sealant in embryo transfer in IVF and PRP with fibrin glue for repair cartilage and alginate in embryo transfer in IVF
    thank
    Reply

    Posted by: mahdieh g.October 7, 2012, 6:00 AM

    Hi Mahdieh!
    The protocol is published here, so you can download it. If you have any other questions or need some more clarification, please, contact me at ariellashikanov@gmail.com. Thanks!
    Reply

    Posted by: Ariella S.October 8, 2012, 8:47 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter