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 JoVE Bioengineering

3 डी आतंच की तैयारी स्टेम सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए scaffolds

1, 2

1Department of Biology, University of Victoria, 2Department of Mechanical Engineering, Division of Medical Sciences, University of Victoria

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    Summary

    यह काम 3 डी आतंच की तैयारी विवरण के संवर्धन और plutipotent स्टेम कोशिकाओं फर्क करने के लिए scaffolds. इस तरह के scaffolds के स्टेम सेल के व्यवहार पर विभिन्न जैविक यौगिकों के प्रभाव स्क्रीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में दवा वितरण प्रणाली को शामिल करने के लिए संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

    Date Published: 3/02/2012, Issue 61; doi: 10.3791/3641

    Cite this Article

    Kolehmainen, K., Willerth, S. M. Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (61), e3641, doi:10.3791/3641 (2012).

    Protocol

    प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले नोट: फाइब्रिनोजेन एक रक्त प्रोटीन व्युत्पन्न है और इस प्रकार उचित सुरक्षा प्रशिक्षण से निपटने से पहले पूरा किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के 2 दिन के समय तो वांछित स्टेम संस्कृतियों को उचित सुनिश्चित करने के लिए वे बोने के लिए तैयार कर रहे हैं को पूरा करने के लिए की आवश्यकता है. कितना फाइब्रिनोजेन बाहर वजन करने के लिए, तीन tris की 35 मिमी पेट्री डिश की गणना के संदर्भ में खारा बफर (टीबीएस, 7.4 पीएच) के 3 एमएल टीबीएस में भंग फाइब्रिनोजेन का 110-130 मिलीग्राम से युक्त 1 24 अच्छी तरह से 400 से युक्त थाली का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त होगा प्रत्येक अच्छी तरह से में μl आतंच scaffolds है.

    1. एक दिन: फाइब्रिनोजेन समाधान और रात भर डायलिसिस

    1. Lyophilized फाइब्रिनोजेन रेफ्रिजरेटर के बाहर ले जाओ और इसे 20 मिनट के लिए बैठने के लिए यह कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं.
    2. जोड़ें Tris के 3 एमएल प्रत्येक 35 मिमी पेट्री डिश में खारा (टीबीएस) के बफर. फाइब्रिनोजेन पैदावार के प्रत्येक प्लेट फाइब्रिनोजेन समाधान के 2 से 3 एमएल एकाग्रता में 12 से 20 से लेकरमिलीग्राम / एमएल और फाइब्रिनोजेन की कुल राशि की जरूरत है इन approximations के आधार पर गणना की जा सकती है.
    3. 100-130 मिलीग्राम लगभग फाइब्रिनोजेन (FG) वजन और प्रत्येक पकवान में टीबीएस वर्तमान की सतह पर छिड़क. फाइब्रिनोजेन के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए समाधान में जाने के लिए शुरू. ढक्कन के साथ कवर पेट्री डिश.
    4. सेते हैं पेट्री डिश 37 डिग्री सेल्सियस 2 घंटे के लिए पूरी तरह से फाइब्रिनोजेन टीबीएस समाधान में जाने के लिए अनुमति देने के लिए.
    5. टीबीएस साथ गीला डायलिसिस टयूबिंग (सात हज़ार मेगावाट काट). टयूबिंग और दबाना अंत मोड़ो नीचे अंत एक डायलिसिस दबाना के साथ बंद.
    6. डायलिसिस टयूबिंग में बर्तन से फाइब्रिनोजेन समाधान विंदुक. शीर्ष अंत पर मोड़ो और दबाना एक डायलिसिस दबाना के साथ बंद.
    7. जगह डायलिसिस टयूबिंग टीबीएस की 4 लीटर कंटेनर में फाइब्रिनोजेन समाधान युक्त है. मिक्स हलचल कम गति (100 आरपीएम) के लिए सेट थाली का उपयोग समाधान.
    8. समाधान रातोंरात Dialyze पर कम से कम 12 घंटे के लिए थाली हलचल. टीबीएस समाधान करने के लिए इस समय अवधि में बदला जा जरूरत नहीं है.
    9. 2. दिन 2: scaffolds में आतंच scaffolds और स्टेम कोशिकाओं के बोने की polymerization

      इस प्रक्रिया के लिए वर्णित चरणों के सभी एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में इन scaffolds स्टेम सेल संस्कृतियों के साथ वरीयता प्राप्त जाएगा.

      1. एक उपयुक्त आकार चोटीदार ट्यूब (या तो 15 या 50 एमएल एमएल) में डायलिसिस टयूबिंग और जगह से फाइब्रिनोजेन समाधान निकालें.
      2. एक 5.0 माइक्रोन सिरिंज के समाधान में बड़ी अशुद्धियों को दूर फिल्टर के साथ फिल्टर फाइब्रिनोजेन समाधान. समाधान की मात्रा पर निर्भर करता है, एकाधिक फिल्टर का उपयोग करने के लिए पूरे समाधान की प्रक्रिया के लिए आवश्यक हो सकता है.
      3. बाँझ फिल्टर 0.22 एक 50ml चोटीदार ट्यूब में फिल्टर माइक्रोन के साथ फाइब्रिनोजेन समाधान. एक उपयुक्त आकार विंदुक का उपयोग, फ़िल्टर फाइब्रिनोजेन उपयोग के लिए बाद में जब गणना कर समाधान की मात्रा का निर्धारण करते हैं. समाधान की मात्रा पर निर्भर करता है, एकाधिक फिल्टर का उपयोग आवश्यक हो ईएनटी प्रक्रिया हो सकती हैगुस्सा समाधान.
      4. 280 एनएम का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में फाइब्रिनोजेन समाधान के absorbance के उपाय. 50 की एक कमजोर पड़ने कारक अक्सर 1 के अंतर्गत एक absorbance प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
      5. फाइब्रिनोजेन निम्न समीकरण का उपयोग कर समाधान में प्रोटीन वर्तमान की एकाग्रता की गणना [मिलीग्राम / एमएल में फाइब्रिनोजेन] = (A × कमजोर पड़ने फैक्टर 280) ÷ 1.55 जहां 1.55 280 एक मानव 13 फाइब्रिनोजेन के लिए विलुप्त होने के गुणांक है. अगले टीबीएस फाइब्रिनोजेन की प्रारंभिक मात्रा के आधार पर 11.1 मिलीग्राम / एमएल समाधान की एकाग्रता को कमजोर करने की जरूरत की राशि की गणना. आतंच scaffolds में प्रोटीन की एकाग्रता अंतिम 10 / मिलीग्राम एमएल polymerization के बाद हो जाएगा.
      6. बाँझ थ्रोम्बिन और कैल्शियम क्लोराइड समाधान प्राप्त करें. सबसे पहले, 15 μL थ्रोम्बिन समाधान जोड़ने (एकाग्रता: 40 यू / एमएल - पाड़ में अंतिम एकाग्रता 2 यू एमएल / होगा) 24 अच्छी तरह से थाली की पहली पंक्ति में एक अच्छी तरह से सही पक्ष. अगले, 50 मिमी कैल्शियम chl 15 μL जोड़ेंप्रत्येक अच्छी तरह से बाईं ओर oride समाधान. अंत में, थाली फाइब्रिनोजेन समाधान के 270 μL जोड़ें. हिला थाली की ओर से पक्ष को सामने करने के लिए वापस मिलाते हुए समाधान के मिश्रण को सुनिश्चित करने के द्वारा पीछा किया.
      7. चलो पंक्ति युक्त मिश्रण कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए भाजन करना. scaffolds के अधिक अपारदर्शी हो गया है के रूप में वे भाजन करना.
      8. 2.6 और 2.7 कदम दोहराएँ जब तक आतंच scaffolds के वांछित संख्या polymerized किया गया है.
      9. पिछले 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर प्लेटों जगह scaffolds की पूरी polymerization के लिए अनुमति.
      10. के बाद एक घंटे के ऊष्मायन पूरा हो गया है, अगले कदम embryoid निकायों के साथ पाड़ बीज है. एक 20 μL pipettemen का उपयोग, एक व्यक्ति embryoid शरीर और आतंच पाड़ के बीच में जगह का चयन करें. खुर्दबीन के साथ की जाँच करें कि एक अच्छी तरह से एक embryoid शरीर होता है.
      11. और 50 मिमी कैल्शियम क्लोराइड की 5 μL: थ्रोम्बिन समाधान के 5 μL (40 यू / एमएल एकाग्रता)प्रत्येक embryoid के फाइब्रिनोजेन समाधान की एक अच्छी तरह से 90 μL द्वारा बाद शरीर के शीर्ष पर समाधान. समाधान एक embryoid निकायों encapsulating के बुलबुले फार्म चाहिए.
      12. 37 ° सी इनक्यूबेटर में वापस थाली polymerization सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त घंटे के लिए जगह.
      13. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से और जगह थाली करने के लिए उचित सेल संस्कृति मीडिया के 1 एमएल वापस जोड़ 37 ° सी इनक्यूबेटर में.

      3. प्रतिनिधि परिणाम

      चित्रा 1 से पता चलता है एक अच्छी तरह से 3 डी आतंच पाड़ संस्कृति embryoid शरीर 2A चित्रा. के साथ वरीयता प्राप्त प्रणाली से युक्त व्यक्ति की ओर देखने का एक योजनाबद्ध माउस प्रेरित pluripotent स्टेम माउस भ्रूण fibroblast फीडर परतों पर संवर्धित कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है. इन कोशिकाओं को फिर embryoid निकायों, तंत्रिका progenitors युक्त कोशिकाओं का समुच्चय है, का प्रयोग करते हुए एक 8 दिन retinoic एसिड उपचार (चित्रा 2B) प्रोटोकॉल previousl के रूप में के रूप में करने के लिए प्रेरित कर रहे हैंवाई 14 में वर्णित है, जबकि चित्रा 3 3 3 डी आतंच scaffolds के अंदर संस्कृति के दिनों के बाद एक आईपीएस व्युत्पन्न embryoid शरीर की उपस्थिति से पता चलता है. इसी तरह के परिणाम पहले से प्राप्त किया गया है माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं 7 का उपयोग कर. इसके अतिरिक्त, इस विधि संस्कृति आईपीएस व्युत्पन्न embryoid निकायों के लिए इस्तेमाल किया गया है का उत्पादन एक अलग retinoic एसिड और 3 डी आतंच scaffolds के 15 अंदर purmorphamine के शामिल प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, इस संस्कृति प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन.

      आकृति 1.
      चित्रा 1 embryoid शरीर के साथ अच्छी तरह से एक 3 डी आतंच पाड़ वरीयता प्राप्त युक्त व्यक्ति के पक्ष दृश्य दिखा रहा है योजनाबद्ध.

      चित्रा 2.
      चित्रा 2. माउस प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) संस्कृति और भेदभाव. इन कोशिकाओं neur में अंतरअल phenotypes, आईपीएस कोशिकाओं के निलंबन में संवर्धित कर रहे हैं embryoid निकायों (ईबीएस) कहा जाता है कोशिकाओं का समुच्चय का उत्पादन. इन ईबीएस तो retinoic एसिड के साथ व्यवहार कर रहे हैं तंत्रिका भेदभाव प्रेरित और इस प्रोटोकॉल पहले से भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव को प्रेरित किया गया था. ए) undifferentiated माउस आईपीएस सेल कॉलोनी एक माउस भ्रूण fibroblast फीडर परत पर सभ्य है. बी) embryoid निलंबन संस्कृति में माउस आईपीएस कोशिकाओं से व्युत्पन्न शरीर retinoic एसिड के साथ इलाज के बाद 8 दिन पर लिया तंत्रिका भेदभाव प्रेरित. पैमाने पर पट्टी 100 माइक्रोन है.

      चित्रा 3.
      चित्रा 3 एक माउस आईपीएस के उदाहरण परिणाम संस्कृति के 3 दिन के बाद एक 3 डी आतंच पाड़ के अंदर शरीर embryoid. कोशिकाओं की ओर पलायन के लिए और आतंच पाड़ के अंदर अंतर करने के लिए शुरू कर दिया है. स्केल बार 500 माइक्रोन है.

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    Discussion

    इस प्रोटोकॉल के ऊपर विस्तृत pluripotent स्टेम सेल संस्कृति के लिए 3 डी आतंच scaffolds के सृजन, माउस भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के लिए विशेष रूप से करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. इस 3 डी biomaterial आधारित संस्कृति प्रणाली को और अधिक सही रूप में स्टेम सेल vivo में पाया आला mimics और एक परिणाम के रूप में, यह जैविक संकेत स्क्रीन करने के लिए स्टेम सेल 6 भेदभाव पर उनके प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी टिप्पणियों से पता चला है कि इन scaffolds जब स्टेम सेल व्युत्पन्न embryoid शरीर पूरी तरह से अपमानित होने से पहले इन विट्रो में 2 सप्ताह के लिए रहने के साथ वरीयता प्राप्त है. आगे इन scaffolds की स्थिरता में वृद्धि, aprotinin (एक protease अवरोध करनेवाला) सेल संस्कृति मीडिया के अलावा के माध्यम से गिरावट धीमा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 7,16 इन scaffolds के भी सफलतापूर्वक तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों, विशेष रूप से ऊतक की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया है. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के 17 में पाया गया कि के समान है. जबकि अन्य जीआरoups Ischemic 18 स्ट्रोक के इलाज के लिए आतंच गोंद आईपीएस कोशिकाओं के साथ संयुक्त है, यह काम है आतंच scaffolds के साथ तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आईपीएस कोशिकाओं के संयोजन की पहली रिपोर्ट में जाना जाता है का प्रतिनिधित्व करता है. यह काम भी में आतंच scaffolds के साथ अन्य ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए स्टेम सेल प्रकार की एक सीमा के संयोजन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा की.

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

    Acknowledgements

    लेखकों के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए ऊतक इंजीनियर scaffolds के NSERC डिस्कवरी अनुदान 402,462 स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment needed:
    Analytical balance
    pH meter
    Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
    Stir plate
    Spectrophotometer
    Sterile tissue culture hood
    Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
    50 mM calcium chloride solution
    Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
    35 mm Petri dishes
    Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
    Dialysis clips
    5.0 μm syringe filters
    Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
    Syringe
    24 well tissue culture plates
    Fibrinogen (human) Calbiochem 341578
    Thrombin (human) Sigma-Aldrich T7009

    References

    1. Keung, A.J., Healy, K.E., Kumar, S., & Schaffer, D.V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64, doi:10.1002/wsbm.46 (2010).
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    Comments

    2 Comments

    How were the embryoid bodies visualised if the fibrin scaffold they were seeded in was opaque?
    Reply

    Posted by: Steph H.June 20, 2012, 6:23 PM

    The embryoid bodies can still be visualized using light microscopy after they have been seeded inside the scaffold. The change in the fibrin solution from being clear to turning white after polymerization is visible without using microscopy, but the scaffolds aren't completely opaque and the cells can still be imaged using a microscope.
    Reply

    Posted by: Stephanie W.June 21, 2012, 11:37 AM

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