Name: Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Impara a preparare scaffold 3D di fibrina per la coltura e differenziazione di cellule staminali pluripotenti. Questo metodo consente di studiare il comportamento cellulare in un microambiente tridimensionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare NSERC Discovery Grant 402462 &quot;scaffolds di ingegneria tessutale indotta per il controllo delle cellule staminali pluripotenti comportamento&quot;.

Note prima di iniziare il protocollo: Il fibrinogeno è una proteina del sangue derivato e formazione sulla sicurezza quindi opportuno deve essere completata prima manipolazione. Questo protocollo richiede 2 giorni per completare così il tempo delle culture staminali desiderati in modo appropriato per assicurare che siano pronti per la semina. In termini di calcolare la quantità di fibrinogeno da pesare, tre piastre da 35 mm di Petri di soluzione salina tamponata Tris (TBS, pH 7,4) contenente 110-130 mg di fibrinogeno sciolto in 3 ml di TBS sarà sufficiente a produrre 1 24 pozzetti contenente 400 ponteggi fibrina pl in ogni pozzetto. 1. Day One: Making soluzioni di fibrinogeno e la dialisi per tutta la notte <ol><li> Prendere fibrinogeno liofilizzato fuori dal frigorifero e lasciare riposare per 20 minuti per permettere di venire a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 3 mL di soluzione salina tamponata Tris (TBS) a ciascuna capsula di Petri 35 millimetri. Ciascuna piastra di rendimenti fibrinogeno 2 a 3 ml di soluzione di fibrinogeno che vanno in concentrazione 12-20mg / ml e la quantità totale di fibrinogeno necessario può essere calcolato sulla base di queste approssimazioni. </li><li> Pesare circa 100-130 mg di fibrinogeno (Fg) e cospargere sulla superficie del presente TBS in ogni piatto. Attendere 5 minuti per il fibrinogeno per iniziare ad andare in soluzione. Coprire con coperchio capsula di Petri. </li><li> Incubare le piastre di Petri a 37 ° C per 2 ore per permettere il fibrinogeno di andare completamente nella soluzione TBS. </li><li> Dialisi tubo Wet (7000 MW tagliata) con TBS. Fold estremità inferiore della fine tubo e pinza chiusa con una fascetta dialisi. </li><li> Pipettare le soluzioni di fibrinogeno, dai piatti in tubi di dialisi. Ripiegare estremità superiore e bloccare chiuso con una fascetta dialisi. </li><li> Luogo dialisi tubo contenente la soluzione di fibrinogeno in un contenitore 4 di litro di TBS. Mix soluzione con piastra di agitazione impostato a bassa velocità (100 rpm). </li><li> Dializzare soluzione di pernottamento a mescolare piastra per almeno 12 ore. La soluzione TBS non deve essere cambiata in questo periodo di tempo. </li></ol&gt; 2. Giorno 2: Polimerizzazione di ponteggi di fibrina e la semina di cellule staminali in ponteggi Tutte le fasi descritte per tale processo deve essere eseguito in una cappa sterile coltura tissutale come questi scaffold saranno seminate con colture di cellule staminali. <ol><li> Rimuovere la soluzione di fibrinogeno dal tubo di dialisi e posto in un apposito tubo dimensionato conica (o 15 ml o 50 mL). </li><li> Fibrinogeno soluzione filtro con un filtro a siringa da 5,0 um per rimuovere le impurità grandi nella soluzione. A seconda del volume della soluzione, l&#39;utilizzo di più filtri può essere necessario elaborare l&#39;intera soluzione. </li><li> Filtro sterile con la soluzione di fibrinogeno da 0,22 micron filtro in un tubo conico 50mL. Usando una pipetta di dimensioni adeguate, determinare il volume della soluzione filtrata fibrinogeno da utilizzare in seguito quando fare calcoli. A seconda del volume della soluzione, l&#39;utilizzo di più filtri può essere necessario elaborare il entire soluzione. </li><li> Misurare assorbanza della soluzione di fibrinogeno a 280 nm usando uno spettrofotometro. Un fattore di diluizione 50 è spesso necessario per ottenere una assorbanza sotto 1. </li><li> Calcolare la concentrazione di proteine ​​presenti nella soluzione fibrinogeno utilizzando la seguente equazione: [Fibrinogeno in mg / ml] = (A 280 × diluizione Factor) 1,55 ÷ 1,55 dove è il coefficiente di estinzione a 280 A per il fibrinogeno umano 13. Avanti calcolare la quantità di TBS necessaria per diluire la concentrazione della soluzione di 11,1 mg / ml di fibrinogeno in base al volume iniziale. La concentrazione finale di proteine ​​nella ponteggi fibrina sarà di 10 mg / ml dopo la polimerizzazione. </li><li> Ottenere trombina sterile e soluzioni di cloruro di calcio. In primo luogo, aggiungere 15 ul di soluzione di trombina (concentrazione: 40 U / mL - concentrazione finale in scaffold sarà di 2 U / mL) a destra di ciascun pozzetto nella prima riga della piastra a 24 pozzetti. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di 50 CHL calcio mMoride soluzione al lato sinistro di ciascun pozzetto. Infine, aggiungere 270 microlitri della soluzione di fibrinogeno alla piastra. Agitare piastra da lato a lato, poi scuotere posteriore a quella anteriore per garantire la miscelazione delle soluzioni. </li><li> Sia la riga contenente la miscela polimerizzare per 5 minuti a temperatura ambiente. Le impalcature diventano più opachi come polimerizzare. </li><li> Ripetere le fasi 2.6 e 2.7 fino al numero desiderato di ponteggi fibrina sono stati polimerizzati. </li><li> Dopo l&#39;ultimo 5 minuti di incubazione, porre le piastre all&#39;interno di un incubatore a 37 ° C per consentire la completa polimerizzazione ponteggi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione uno ora è completa, il passo successivo è alle sementi al patibolo con corpi embrionali. Utilizzando un pipettemen 20 microlitri, selezionare un corpo individuale embrioide e posto al centro del patibolo fibrina. Verificare con il microscopio che ogni pozzetto contiene un unico corpo embrioide. </li><li> Aggiungere 5 pl di soluzione di trombina (concentrazione: 40 U / mL) e 5 microlitri di 50 mM cloruro di calciosoluzione su ciascun corpo embrioide seguito da 90 microlitri di soluzione di fibrinogeno ad ogni pozzetto. La soluzione deve formare una bolla che incapsula i corpi embrionali. </li><li> Luogo piastra posteriore in incubatore a 37 ° C per un&#39;ora supplementare per garantire la polimerizzazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 1 mL dei mezzi appropriati di colture cellulari per ogni piatto ben luogo e indietro nel 37 ° C incubatore. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Figura 1 mostra una schematica vista laterale di un singolo pozzetto contenente il 3D fibrina sistema cultura scaffold seminati con un corpo embrioide. Figura 2A mostra immagini rappresentative di cellule staminali pluripotenti indotte topo in coltura su strati di fibroblasti embrionali di topo feeder. Queste cellule vengono quindi indotte a formare corpi embrionali, aggregati di cellule contenenti progenitori neurali, utilizzando uno 8 giorni retinoico protocollo di trattamento (Figura 2B) come previously descritto 14 mentre la Figura 3 mostra l&#39;aspetto di un IPS-derivato corpo embrioide dopo 3 giorni di coltura all&#39;interno di 3D ponteggi fibrina. Risultati simili sono stati ottenuti in precedenza con cellule staminali embrionali di topo 7. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per la cultura IPS-derivati ​​corpi embrionali prodotte utilizzando un protocollo diverso, con l&#39;acido retinoico e purmorphamine 15 all&#39;interno del 3D ponteggi fibrina, a dimostrazione della versatilità di questo sistema di coltura. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig1.jpg" /> Figura 1. Schematico che mostra la vista laterale di un singolo pozzetto contenente un 3D fibrina scaffold seminato con un corpo embrioide. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig2.jpg" /> Figura 2. Mouse staminali pluripotenti indotte (iPS), coltura cellulare e la differenziazione. Per differenziare queste cellule in neurfenotipi al, le cellule iPS sono coltivate in sospensione per la produzione di aggregati di cellule chiamate corpi embrionali (EBS). Questi EBs vengono poi trattate con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale e questo protocollo è stato precedentemente usato per indurre il differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali. A) indifferenziato topo cellule iPS colonia coltivati ​​su una embrionale strato di fibroblasti topo alimentatore. B) corpi embrionali derivate da cellule iPS topo in coltura in sospensione adottata il giorno 8 dopo trattamento con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale. Barra della scala è di 100 micron. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3641/3641fig3.jpg" /> Risultati dell&#39;esempio Figura 3. Di un IPS topo embryoid corpo dopo 3 giorni di coltura all&#39;interno di uno scaffold 3D fibrina. Le cellule hanno cominciato a migrare e differenziarsi all&#39;interno del patibolo fibrina. Barra della scala è di 500 micron.

<ol><li>Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+and+dynamics+of+natural+and+engineered+stem+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Syst.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).</li>
<li>Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillerth%2C+SM+%22StemBook%22">StemBook</a>. , (2008).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin%3A+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).</li>
<li>Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+a+delivery+system+for+therapeutic+drugs+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).</li>
<li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li>
<li>Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fibrin+scaffolds+for+differentiation+of+murine+embryonic+stem+cells+into+neural+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells.</a> Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).</li>
<li>Gorodetsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+Microbeads+Loaded+with+Mesenchymal+Cells+Support+Their+Long-Term+Survival+While+Sealed+at+Room+Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature.</a> Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).</li>
<li>Barsotti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+acts+as+biomimetic+niche+inducing+both+differentiation+and+stem+cell+marker+expression+of+early+human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells.</a> Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).</li>
<li>Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin+constructs+evaluated+in+vitro+and+in+nude+mouse+and+rabbit+defects+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models.</a> Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).</li>
<li>Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+fibrinogen+and+thrombin+concentrations+promote+neuronal+rather+than+glial+growth+when+primary+neural+cells+are+seeded+within+plasma-derived+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).</li>
<li>Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+for+expansion+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).</li>
<li>Dellenback, R. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extinction+coefficient+of+fibrinogen+from+man%2C+dog%2C+elephant%2C+sheep%2C+and+goat+at+280+mmu%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+ventral+spinal+progenitors+and+motor+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules.</a> Stem Cells. 26, 886-893 (2008).</li>
<li>Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+aprotinin+for+improved+stability+of+fibrin+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials.</a> Biomaterials. 32, 430-438 (2011).</li>
<li>Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+controlled+growth+factor+delivery+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+fibrin+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds.</a> Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).</li>
<li>Chen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+improvement+of+focal+cerebral+ischemia+injury+by+subdural+transplantation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+fibrin+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue.</a> Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo dettagliato sopra fornisce un metodo per generare 3D ponteggi di fibrina per la coltura di cellule staminali pluripotenti, in particolare per embrionali di topo e cellule staminali pluripotenti indotte. Questo sistema biomateriale cultura 3D basato più accuratamente imita la nicchia delle cellule staminali trovato in vivo e, di conseguenza, può essere usata per selezionare segnali biologici per determinare i loro effetti sulla differenziazione delle cellule staminali 6. Le nostre os...

Attrezzatura necessaria: Bilancia analitica pH-metro Tissue incubatore (37 ° C, 5% CO 2) Mescolare piastra Spettrofotometro Sterile tessuto cappa cultura Tris soluzione salina tamponata (pH 7.4) (Need 4 L plus abbastanza per sciogliere fibrinogeno) 50 mM di soluzione di cloruro di calcio Sterili provette coniche (15 o 50 mL) 35 mm Scatole Petri Dialisi tubi (7.000 MW cutoff) Dialisi clip 5.0 micron filtri per siringa Confezionati singolarmente siringhe sterili 0,22 micron filtri Siringa 24 e piastre di coltura di tessuto <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Fibrinogeno (umano) </td><td> Calbiocorlo </td><td> 341578 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina (umana) </td><td> Sigma </td><td> T7009 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del 3d fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali cultura

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Cellule staminali si trovano in natura microambienti 3D in vivo, che sono spesso denominati nicchia cellule staminali 1. Coltura di cellule staminali all&#39;interno di 3D scaffold biomateriale fornisce un modo per riprodurre accuratamente questi microambienti, fornendo un vantaggio rispetto ai tradizionali metodi di coltura 2D utilizzando polistirene nonché un metodo per tessuti di ricambio ingegneria 2. Mentre 2D polistirene coltura tissutale è stato utilizzato per la maggior parte degli esperimenti di coltura cellulare, 3D ponteggi biomateriale può più strettamente replicare i microambienti trovate in vivo consentendo costituzione più accurata di polarità cella nell&#39;ambiente e possiede proprietà biochimiche e meccaniche simili a tessuti molli. 3 Una varietà di derivazione naturale e sintetico ponteggi biomateriale sono stati studiati come ambienti in 3D per sostenere la crescita delle cellule staminali. Mentre ponteggi sintetici possono essere sintetizzati per avere una maggiore range di proprietà meccaniche e chimiche e spesso hanno una maggiore riproducibilità, biomateriali naturali sono spesso composti di proteine ​​e polisaccaridi presenti nella matrice extracellulare e di conseguenza contengono siti di legame per l&#39;adesione cellulare e facilmente sostenere la coltura cellulare. Ponteggi fibrina, prodotto polimerizzando il fibrinogeno proteina ottenuta da plasma, sono stati ampiamente studiati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale sia in vitro e in vivo 4. Tali ponteggi può essere modificata utilizzando una varietà di metodi per incorporare sistemi a rilascio controllato per fornire fattori terapeutici 5. Studi precedenti hanno dimostrato che tali ponteggi può essere utilizzato con successo per coltura di cellule staminali embrionali e questo scaffold sistema di coltura può essere usata per selezionare gli effetti di vari fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali seminate dentro 6,7. Questo protocollo dettagli il processo di polymerizing fibrina ponteggi da soluzioni fibrinogeno utilizzando l&#39;attività enzimatica della trombina. Il processo si fa in 2 giorni per completare, compresa una fase di dialisi per tutta la notte per la soluzione del fibrinogeno per rimuovere citrati che inibiscono la polimerizzazione. Questi metodi dettagliati contare su concentrazioni di fibrinogeno determinati a essere ottimale per la coltura embrionale e indotto cellule staminali pluripotenti. Altri gruppi hanno ulteriormente investigato ponteggi fibrina per una vasta gamma di tipi di cellule e applicazioni - dimostrare la versatilità di questo approccio 8-12.

Questi i dettagli del lavoro per la preparazione di fibrina scaffold 3D per la coltura e differenziazione delle cellule staminali plutipotent. Tali ponteggi può essere usata per selezionare gli effetti di vari composti biologici sul comportamento cellule staminali nonché modificata per contenere sistemi di drug delivery.

Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Le cellule staminali si trovano in vivo all'interno di microambienti 3D naturali, spesso definiti nicchie delle cellule staminali 1. La coltura di cellule staminali ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare scaffold di fibrina tridimensionali per la coltura e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti, inclusi le cellule staminali embrionali e le cellule staminali pluripotenti indotte. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando soluzioni di fibrinogeno e dializzandole per tutta la notte per rimuovere le molecole che inibiscono la polimerizzazione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel polimerizzare uno strato basale inferiore di fibrina in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'effettuare la semina. Un singolo corpo embrionale derivato da cellule staminali pluripotenti viene posizionato sullo strato basale dell'impalcatura, seguito dall'aggiunta di un secondo strato di fibrina per completare l'incapsulamento. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'aggiunta del mezzo di coltura cellulare appropriato sugli impalcature.A seconda dell'applicazione, si possono ottenere risultati definitivi che dimostrano come corpi embrionali derivati da cellule staminali pluripotenti possano essere coltivati con successo all'interno di impalcature tridimensionali a base di fibrina e biomateriali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare in 2D è la possibilità di osservare e manipolare il comportamento delle cellule staminali in tre dimensioni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla biologia delle cellule staminali, analizzando fattori come composti chimici e fattori di crescita che influenzano il loro comportamento in un microambiente 3D. Il fibrinogeno è una proteina di origine sanguigna e pertanto è necessario completare un'adeguata formazione sulla sicurezza prima di manipolarlo.Per iniziare, rimuovere il fibrinogeno liofilizzato dal frigorifero e lasciarlo a riposo per 20 minuti affinché raggiunga la temperatura ambiente; aggiungere tre millilitri di soluzione salina tamponata al tris in ciascuna piastra di Petri da 35 millimetri. Pesare circa da 100 a 130 milligrammi di fibrinogeno e spargerlo sulla superficie della soluzione TBS in ogni piastra. Attendere cinque minuti affinché il fibrinogeno inizi a solubilizzarsi.Quindi coprire la piastra di Petri con il coperchio. Incubare le piastre di Petri a 37 gradi Celsius per due ore per permettere al fibrinogeno di passare completamente in soluzione. Successivamente, inumidire un tubo da dialisi con TBS, piegare l'estremità inferiore del tubo e chiuderla con mollette da dialisi, quindi pipettare la soluzione di fibrinogeno dalle piastre all'interno del tubo da dialisi.Poi piegare l'estremit&agrave; superiore e chiuderla con una molletta per dialisi. Posizionare il tubo da dialisi contenente la soluzione di fibrinogeno in un contenitore da quattro litri di TBS. Mescolare la soluzione.Utilizzando un agitatore magnetico impostato su velocità bassa, dializzare la soluzione tutta la notte sulla piastra per almeno 12 ore. La soluzione di T Bs non necessita di essere cambiata durante questo periodo sotto un capo a flusso laminare sterile. Rimuovere la soluzione di fibrinogeno dalla membrana dialitica e trasferirla in una provetta conica.Filtrare la soluzione di fibrinogeno con un filtro per siringa da cinque micron per rimuovere le impurità più grandi presenti nella soluzione. Successivamente, utilizzare un filtro da 0,22 micron per filtrare e sterilizzare la soluzione di fibrinogeno in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver determinato il volume totale, misurare l'assorbanza della soluzione di fibrinogeno a 280 nanometri; spesso è necessario un fattore di diluizione di 50 per ottenere un'assorbanza inferiore a uno.Calcolare la concentrazione di proteina presente nella soluzione di fibrinogeno utilizzando la seguente equazione, in cui la concentrazione di fibrinogeno in milligrammi per millilitro è uguale a due volte il fattore di diluizione diviso per 1,55, dove 1,55 è il coefficiente di estinzione a 280 per il fibrinogeno umano. Successivamente, calcolare la quantità di TBS necessaria per diluire la concentrazione della soluzione fino a 11,1 milligrammi per millilitro di fibrinogeno in base al volume iniziale. La concentrazione finale di proteina nei supporti di fibrina sarà di 10 milligrammi per millilitro.Dopo la polimerizzazione, aggiungere 15 microlitri di una soluzione di trombina a 40 unità per millilitro nel lato destro di ogni pozzetto della prima riga della piastra a 24 pozzetti, quindi aggiungere 15 microlitri di una soluzione di cloruro di calcio a 50 millimolari nel lato sinistro di ciascun pozzetto. Infine, aggiungere 270 microlitri della soluzione di fibrinogeno nella piastra. Agitare la piastra da un lato all'altro e da davanti a dietro per mescolare le soluzioni.Lasciare polimerizzare la fila contenente le miscele per cinque minuti. A temperatura ambiente, gli scaffold diventano più opachi man mano che polimerizzano; continuare a produrre file di fibrinogeno polimerizzato una alla volta fino a ottenere il numero desiderato di scaffold di fibrina. Dopo l'ultima incubazione di cinque minuti, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora per completare la polimerizzazione degli scaffold. Al termine dell'incubazione di un'ora.Sezionare l'impalcatura utilizzando una pipetta manuale da 20 microlitri per selezionare un singolo corpo embrionale e posizionarlo al centro dell'impalcatura di fibrina. Verificare al microscopio che ogni pozzetto contenga un solo corpo embrionale. Aggiungere cinque microlitri di soluzione di trombina e cinque microlitri di soluzione di cloruro di calcio 50 millimolare sopra ciascun corpo embrionale, seguiti da 90 microlitri di soluzione di fibrinogeno in ogni pozzetto; la soluzione deve formare una bolla che incapsula il corpo embrionale.Incubare la piastra per un'ulteriore ora a 37 gradi Celsius per assicurare la polimerizzazione dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro del mezzo di coltura cellulare appropriato in ogni pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Qui vengono mostrate immagini rappresentative di cellule staminali pluripotenti indotte di topo coltivate su strati di supporto di fibroblasti embrionali di topo. Mediante un protocollo di trattamento con acido retinoico della durata di otto giorni, le cellule vengono indotte a formare corpi embrionali, aggregati cellulari contenenti progenitori neurali come mostrato in questo caso.Questa figura mostra l'aspetto di un corpo embrionale derivato da IPS dopo tre giorni di coltura all'interno di impalcature tridimensionali di fibrina. Risultati simili sono stati ottenuti in precedenza utilizzando cellule staminali embrionali di topo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come seminare corpi embrionali all'interno di impalcature tridimensionali di fibrina utilizzando questo processo di due giorni.Non dimenticare che lavorare con il fibrinogeno può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare adeguate precauzioni, tra cui l'uso di dispositivi di protezione individuale e lo smaltimento corretto dei rifiuti, durante l'esecuzione di questa procedura.

preparation-of-3d-fibrin-scaffolds-for-stem-cell-culture-applications

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo sistema modello parte da un gel di fibrina myofibroblast popolata che può essere usato per studiare collagene endogeno (ri) organizzazione in tempo reale in modo non distruttivo. Il sistema modello è molto sintonizzabile, in quanto può essere usato con sorgenti cellulari differenti, additivi medie, e può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche.

Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

I progressi nelle tecnologie dei biomateriali consentono lo sviluppo di costrutti tridimensionali di tipo multicellulare. Abbiamo sviluppato protocolli di elettrofilatura per produrre tre scaffold individuali per coltivare le principali cellule strutturali delle vie aeree per fornire un modello 3D in vitro della parete dei bronchioli delle vie aeree.

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l'ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).

Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali

L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire una co-coltura dinamica di macrofagi e miofibroblasti umani in scaffold elettrofilari tubolari per studiare la rigenerazione tissutale guidata dal materiale, utilizzando un bioreattore che consente il disaccoppiamento dello stress da taglio e dell'allungamento ciclico.

Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

Questo protocollo fornisce metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D e descrive il loro uso nelle modalità di screening preclinico dei farmaci. I metodi descritti utilizzano un sistema di rilevamento magnetico per facilitare la valutazione simultanea di 24 tessuti in parallelo.

Test preclinici di farmaci in tessuti muscolari ingegnerizzati 3D scalabili

Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Impara a preparare scaffold 3D di fibrina per la coltura e differenziazione di cellule staminali pluripotenti. Questo metodo consente di studiare il comportamento cellulare in un microambiente tridimensionale.

Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Esplora altri video