Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Isso detalhes o trabalho de preparação de fibrina scaffolds 3D para cultura e diferenciação das células-tronco plutipotent. Tais suportes podem ser usados ​​para examinar os efeitos de vários compostos biológicos sobre o comportamento das células estaminais, bem como modificada para conter sistemas de entrega de drogas.

O objetivo geral deste procedimento é preparar andaimes de fibrina 3D para cultura e diferenciação de células-tronco pluripotentes, incluindo células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas. Isso é feito primeiro fazendo soluções de fibrinogênio e dialisando-as durante a noite para remover moléculas que inibem a polimerização. A segunda etapa do procedimento é polimerizar uma camada de base inferior de fibrina em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

A terceira etapa do procedimento é semear. O corpo embrionário único é derivado de células-tronco pluripotentes na camada base do andaime, seguido pela adição da segunda camada de fibrina para completar o encapsulamento. A etapa final do procedimento é adicionar os meios de cultura de células apropriados aos andaimes.

Dependendo da aplicação, em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que corpos embrionários derivados de células-tronco pluripotentes podem ser cultivados com sucesso dentro de fibrina 3D, andaimes baseados em biomateriais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos tradicionais de cultura de células 2D é que você pode observar e manipular o comportamento das células-tronco em três dimensões. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a biologia das células-tronco, rastreando fatores como compostos químicos e fatores de crescimento que influenciam o comportamento das células-tronco Em um microambiente 3D, o fibrinogênio é uma proteína derivada do sangue e, portanto, o treinamento de segurança apropriado deve ser concluído antes do manuseio.

Para começar, retire o fibrinogênio liofilizado da geladeira e deixe descansar por 20 minutos para atingir a temperatura ambiente, adicione três mililitros de solução salina tamponada com tris a cada placa de Petri de 35 milímetros. Pese aproximadamente 100 a 130 miligramas de fibrinogênio e polvilhe sobre a superfície do TBS em cada prato. Aguarde cinco minutos para que o fibrinogênio comece a entrar em solução.

Em seguida, cubra a placa de Petri com uma tampa. Incube as placas de Petri a 37 graus Celsius por duas horas para permitir que o fibrinogênio entre totalmente em solução. Em seguida, tubo de diálise úmido com TBS, dobre a extremidade inferior do tubo e prenda a extremidade com braçadeiras de diálise, pipete a solução de fibrinogênio da louça para o tubo de diálise.

Em seguida, dobre a extremidade superior e feche com uma braçadeira de diálise. Coloque o tubo de diálise contendo a solução de fibrinogênio em um recipiente de quatro litros de TBS. Misture a solução.

Usando uma placa de agitação em velocidade baixa, dialise a solução durante a noite na placa por pelo menos 12 horas. A solução de T Bs não precisa ser trocada durante esse tempo sob uma capa de cultura de tecidos estéril. Remova a solução de fibrinogênio do tubo de diálise e coloque-a em um tubo cônico.

Filtre a solução de fibrinogênio com um filtro de seringa de cinco mícrons para remover grandes impurezas da solução. Em seguida, use um filtro de ponto 22 mícrons para filtrar, esterilize a solução de fibrinogênio em um tubo cônico de 50 mililitros. Depois de determinar o volume total, medir a absorbância da solução de fibrinogênio em 280 nanômetros, um fator de diluição de 50 é frequentemente necessário para obter uma absorbância abaixo de um.

Calcular a concentração de proteínas presentes na solução de fibrinogénio utilizando a seguinte equação, em que a concentração de fibrinogénio em miligramas por mililitro é igual a um factor de diluição de duas vezes a 80 vezes dividido por 1,55, em que 1,55 é o coeficiente de extinção a dois 80 para o fibrinogénio humano. Em seguida, calcule a quantidade de TBS necessária para diluir a concentração da solução para 11,1 miligramas por mililitro de fibrinogênio com base no volume inicial. A concentração final de proteína nos andaimes de fibrina será de 10 miligramas por mililitro.

Após a polimerização, adicione 15 microlitros de uma solução de trombina de 40 unidades por mililitro no lado direito de cada poço na primeira fileira da placa de 24 poços e, em seguida, adicione 15 microlitros de uma solução de cloreto de cálcio de 50 milimolares no lado esquerdo de cada um. Bem, finalmente, adicione 270 microlitros da solução de fibrinogênio ao prato. Agite o prato de um lado para o outro e de trás para a frente para misturar as soluções.

Deixe a linha contendo as misturas polimerizar por cinco minutos À temperatura ambiente, os andaimes tornam-se mais opacos à medida que polimerizam, continuam a formar fileiras de fibrinogênio polimerizado, um de cada vez, até que o número desejado de andaimes de fibrina seja obtido. Após os últimos cinco minutos de incubação, incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora para polimerizar completamente os andaimes. Quando a incubação de uma hora estiver completa.

Semeie o andaime usando uma pipeta de 20 microlitros para selecionar um corpo embrionário individual e colocá-lo no centro do andaime de fibrina. Verifique com um microscópio se cada poço contém um único corpo embrionário. Adicione cinco microlitros de solução de trombina e cinco microlitros de solução de cloreto de cálcio 50 milimolares no topo de cada corpo embrionário, seguido por 90 microlitros de solução de fibrinogênio em cada poço, a solução deve formar uma bolha encapsulando o corpo embrionário.

Incubar a placa por mais uma hora a 37 graus Celsius para garantir a polimerização após a incubação, adicionar um mililitro do meio de cultura celular apropriado a cada poço e colocar a placa de volta na incubadora de 37 graus Celsius. Aqui, são mostradas imagens representativas de células-tronco pluripotentes induzidas por camundongos cultivadas em camadas alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongos. Usando um protocolo de tratamento com ácido retinóico de oito dias, as células são induzidas a formar corpos embrionários, agregados de células contendo progenitores neurais, como mostrado aqui.

Esta figura mostra a aparência de um corpo embrionário derivado do IPS após três dias de cultivo dentro de andaimes de fibrina 3D. Resultados semelhantes foram obtidos anteriormente usando células-tronco embrionárias de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como semear corpos embrionários em andaimes de fibrina 3D usando este processo de dois dias.

Não se esqueça de que trabalhar com fibrinogênio pode ser extremamente perigoso e as precauções adequadas, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual e o descarte adequado de resíduos, devem ser tomadas durante a execução deste procedimento.