3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

이 절차의 전반적인 목표는 배아 및 유도 만능 줄기 세포를 포함한 만능 줄기 세포를 배양하고 분화하기 위한 3D 피브린 스캐폴드를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 피브리노겐 용액을 만들고 하룻밤 사이에 투석하여 중합을 억제하는 분자를 제거함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 피브린의 바닥 기층을 중합하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 시드하는 것입니다. 단일 배아체는 만능 줄기세포에서 골격의 기저층에 파생된 후 두 번째 섬유소층을 추가하여 완전한 캡슐화를 수행합니다. 절차의 마지막 단계는 적절한 세포 배양 배지를 골격에 추가하는 것입니다.

응용 분야에 따라 궁극적으로 만능 줄기 세포에서 유래한 배아체가 3D 피브린, 생체 재료 기반 골격 내에서 성공적으로 배양될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 2D 세포 배양 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 줄기 세포의 거동을 3차원으로 관찰하고 조작할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 줄기세포 거동에 영향을 미치는 화합물 및 성장 인자와 같은 요인을 스크리닝하여 줄기세포 생물학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.3D 미세환경에서 피브리노겐은 혈액 유래 단백질이므로 취급 전에 적절한 안전 교육을 이수해야 합니다.

먼저 냉장고에서 동결건조된 피브리노겐을 꺼내 실온이 될 때까지 20분 동안 그대로 두었다가 각 35mm 페트리 접시에 3밀리리터의 트리스 완충 식염수를 추가합니다. 약 100-130mg의 피브리노겐의 무게를 달아 각 접시의 TBS 표면에 뿌립니다. 피브리노겐이 용액으로 들어가기 시작할 때까지 5분 정도 기다립니다.

그런 다음 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다. 페트리 접시를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 피브리노겐이 용액으로 완전히 들어갈 수 있도록 합니다. 다음으로 TBS가 있는 습식 투석 튜브는 튜브의 하단 끝을 접고 투석 클램프로 끝을 닫고 접시의 피브리노겐 용액을 투석 튜브로 피펫으로 닫습니다.

그런 다음 상단 끝을 접고 투석 클램프로 닫으십시오. 피브리노겐 용액이 들어있는 투석 튜브를 TBS의 4 리터 용기에 넣습니다. 용액을 섞습니다.

저속으로 설정된 교반 플레이트를 사용하여 플레이트에서 하룻밤 동안 용액을 최소 12시간 동안 투석합니다. T Bs 용액은 멸균 조직 배양 후드 아래에서 이 시간 동안 변경할 필요가 없습니다. 투석 튜브에서 피브리노겐 용액을 제거하고 원뿔형 튜브에 넣습니다.

5미크론 주사기 필터로 피브리노겐 용액을 여과하여 용액의 큰 불순물을 제거합니다. 그런 다음 포인트 22 미크론 필터를 사용하여 피브리노겐 용액을 여과하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 살균합니다. 총 부피를 측정하여 280나노미터에서 피브리노겐 용액의 흡광도를 측정한 후, 1 미만의 흡광도를 얻기 위해 50의 희석 계수가 필요한 경우가 많습니다.

피브리노겐 용액에 존재하는 단백질의 농도를 다음 방정식을 사용하여 계산하며, 여기서 밀리리터당 밀리그램 단위의 피브리노겐 농도는 80배의 희석 계수 2를 1.55로 나눈 값과 같으며, 여기서 1.55는 인간 피브리노겐에 대한 2 80에서의 소광 계수입니다. 다음으로, 초기 부피를 기준으로 용액의 농도를 피브리노겐 1밀리리터당 11.1mg으로 희석하는 데 필요한 TBS의 양을 계산합니다. 피브린 골격에서 단백질의 최종 농도는 밀리리터당 10mg입니다.

중합 후, 24 웰 플레이트의 첫 번째 줄에 있는 각 웰의 오른쪽에 밀리리터당 40 유닛 트롬빈 용액 15마이크로리터를 추가한 다음 각 왼쪽에 50밀리몰 염화칼슘 용액 15마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로 270마이크로리터의 피브리노겐 용액을 플레이트에 추가합니다. 접시를 좌우로, 뒤에서 앞으로 흔들어 용액을 혼합합니다.

혼합물을 포함하는 행을 5분 동안 중합시키십시오.실온에서, 골격은 중합됨에 따라 더 불투명해지며, 원하는 수의 피브린 골격이 얻어질 때까지 한 번에 하나씩 중합된 피브리노겐 열을 계속 만듭니다. 마지막 5분 배양 후 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 골격을 완전히 중합합니다. 1시간 배양이 완료되면.

20마이크로리터 피펫맨을 사용하여 개별 배아를 선택하고 섬유소 골격 중앙에 배치하여 골격을 파종합니다. 현미경으로 각 웰에 단일 배아체가 포함되어 있는지 확인합니다. 각 배아 본체 위에 5마이크로리터의 트롬빈 용액과 50밀리몰의 염화칼슘 용액 5마이크로리터를 첨가한 다음 각 웰에 90마이크로리터의 피브리노겐 용액을 추가하면 용액이 배아체를 캡슐화하는 거품을 형성해야 합니다.

배양 후 중합을 보장하기 위해 섭씨 37도에서 한 시간 더 플레이트를 배양하고, 각 웰에 적절한 세포 배양 배지 1ml를 추가한 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 여기에서는 마우스 배아 섬유아세포 공급층에서 배양된 마우스 유도 만능 줄기세포의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 8일 레티노산 치료 프로토콜을 사용하여 세포는 여기에 표시된 바와 같이 신경 전구 세포를 포함하는 세포의 집합체인 배아체를 형성하도록 유도됩니다.

이 그림은 3D 섬유소 골격 내에서 3일 동안 배양한 후 IPS 유래 배아체의 모습을 보여줍니다. 이전에 마우스 배아 줄기 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 이틀 간의 과정을 사용하여 배아를 3D 섬유소골에 시딩하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

피브리노겐을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 착용 및 적절한 폐기물 처리를 포함한 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.