Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Diese Arbeit wird die Herstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für die Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen plutipotent. Solche Gerüste verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen biologischen Verbindungen zur Stammzellforschung Verhalten Bildschirm als auch modifiziert werden, um Drug Delivery-Systemen enthalten sein.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Vorbereitung von 3D-Fibringerüsten für die Kultivierung und Differenzierung pluripotenter Stammzellen, einschließlich embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Fibrinogenlösungen hergestellt und über Nacht dialysiert werden, um Moleküle zu entfernen, die die Polymerisation hemmen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, eine untere Basisschicht aus Fibrin in jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte zu polymerisieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Aussaat. Der einzelne Embryokörper wird von pluripotenten Stammzellen auf die Basisschicht des Gerüsts abgeleitet, gefolgt von der Zugabe einer zweiten Fibrinschicht, um die Verkapselung zu vervollständigen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die entsprechenden Zellkulturmedien zu den Gerüsten hinzuzufügen.

Je nach Anwendung können letztendlich Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Embryokörper, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, erfolgreich in 3D-Fibrin-Gerüsten kultiviert werden können, die auf Biomaterialien basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen 2D-Zellkulturmethoden besteht darin, dass Sie das Verhalten von Stammzellen in drei Dimensionen beobachten und manipulieren können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Stammzellbiologie zu beantworten, indem Faktoren wie chemische Verbindungen und Wachstumsfaktoren, die das Verhalten von Stammzellen beeinflussen, untersucht werden. In einer 3D-Mikroumgebung ist Fibrinogen ein aus dem Blut gewonnenes Protein, und daher muss vor der Handhabung eine entsprechende Sicherheitsschulung absolviert werden.

Nehmen Sie zunächst lyophilisiertes Fibrinogen aus dem Kühlschrank und lassen Sie es 20 Minuten lang ruhen, um Raumtemperatur zu erreichen, geben Sie drei Milliliter gepufferte Tris-Kochsalzlösung in jede 35-Millimeter-Petrischale. Wiegen Sie etwa 100 bis 130 Milligramm Fibrinogen ab und streuen Sie es auf die Oberfläche des TBS in jeder Schale. Warten Sie fünf Minuten, bis das Fibrinogen beginnt, in Lösung zu gehen.

Decken Sie dann die Petrischale mit einem Deckel ab. Inkubieren Sie die Petrischalen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit das Fibrinogen vollständig in Lösung gehen kann. Als nächstes Nassdialyseschlauch mit TBS falten Sie das untere Ende des Schlauchs und klemmen Sie das Ende mit Dialyseklemmen zu, pipettieren Sie die Fibrinogenlösung aus den Schalen in den Dialyseschlauch.

Falten Sie dann das obere Ende um und klemmen Sie es mit einer Dialyseklemme zu. Legen Sie den Dialyseschlauch mit der Fibrinogenlösung in einen Vier-Liter-Behälter mit TBS. Mischen Sie die Lösung.

Verwenden Sie eine Rührplatte, die auf niedrige Geschwindigkeit eingestellt ist, dialysieren Sie die Lösung über Nacht mindestens 12 Stunden lang auf der Platte. Die TBS-Lösung muss in dieser Zeit unter einer sterilen Gewebekulturhaube nicht gewechselt werden. Nehmen Sie die Fibrinogenlösung aus dem Dialyseschlauch und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen.

Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung mit einem Fünf-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, um große Verunreinigungen in der Lösung zu entfernen. Verwenden Sie anschließend einen 22-Mikron-Filter zum Filtern und sterilisieren Sie die Fibrinogenlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nach der Bestimmung des Gesamtvolumens misst man die Extinktion der Fibrinogenlösung bei 280 Nanometern, so ist oft ein Verdünnungsfaktor von 50 notwendig, um eine Extinktion unter einem zu erhalten.

Berechnen Sie die Konzentration des in der Fibrinogenlösung vorhandenen Proteins unter Verwendung der folgenden Gleichung, wobei die Konzentration von Fibrinogen in Milligramm pro Milliliter einem zwei 80-fachen Verdünnungsfaktor geteilt durch 1,55 entspricht, wobei 1,55 der Extinktionskoeffizient bei zwei 80 für menschliches Fibrinogen ist. Berechnen Sie als Nächstes die Menge an TBS, die erforderlich ist, um die Konzentration der Lösung auf 11,1 Milligramm pro Milliliter Fibrinogen basierend auf dem Ausgangsvolumen zu verdünnen. Die endgültige Proteinkonzentration in den Fibringerüsten beträgt 10 Milligramm pro Milliliter.

Nach der Polymerisation geben Sie 15 Mikroliter einer Thrombinlösung von 40 Einheiten pro Milliliter auf die rechte Seite jeder Vertiefung in der ersten Reihe der 24-Well-Platte und fügen Sie dann 15 Mikroliter einer 50 millimolaren Calciumchloridlösung auf die linke Seite jeder Vertiefung hinzu. Nun, zum Schluss geben Sie 270 Mikroliter der Fibrinogenlösung auf die Platte. Schütteln Sie den Teller von einer Seite zur anderen und von hinten nach vorne, um die Lösungen zu mischen.

Lassen Sie die Reihe, die die Mischungen enthält, fünf Minuten lang polymerisieren. Bei Raumtemperatur werden die Gerüste undurchsichtiger, während sie polymerisieren und weiterhin Reihen von polymerisiertem Fibrinogen nacheinander bilden, bis die gewünschte Anzahl von Fibringerüsten erreicht ist. Nach der letzten fünfminütigen Inkubation inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Gerüste vollständig zu polymerisieren. Wenn die einstündige Inkubation abgeschlossen ist.

Säen Sie das Gerüst aus, indem Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette einen einzelnen Embryokörper auswählen und ihn in der Mitte des Fibringerüsts platzieren. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob jede Vertiefung einen einzelnen Embryokörper enthält. Geben Sie fünf Mikroliter Thrombinlösung und fünf Mikroliter 50 Millimolare Calciumchloridlösung auf jeden Embryokörper, gefolgt von 90 Mikrolitern Fibrinogenlösung in jede Vertiefung, die Lösung sollte eine Blase bilden, die den Embryokörper einkapselt.

Inkubieren Sie die Platte für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius, um die Polymerisation nach der Inkubation sicherzustellen, geben Sie einen Milliliter des entsprechenden Zellkulturmediums in jede Vertiefung und setzen Sie die Platte wieder in den 37 Grad Celsius Inkubator ein. Hier werden repräsentative Bilder von Maus-induzierten pluripotenten Stammzellen gezeigt, die auf embryonalen Fibroblasten-Feeder-Schichten der Maus kultiviert wurden. Unter Verwendung eines achttägigen Retinsäure-Behandlungsprotokolls werden die Zellen dazu gebracht, Embryokörper zu bilden, Aggregate von Zellen, die neurale Vorläuferzellen enthalten, wie hier gezeigt.

Diese Abbildung zeigt das Aussehen eines IPS-abgeleiteten Embryokörpers nach dreitägiger Kultivierung in 3D-Fibringerüsten. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits mit embryonalen Stammzellen der Maus erzielt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Embryokörper mit diesem zweitägigen Prozess in 3D-Fibringerüste sät.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fibrinogen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, einschließlich des Tragens persönlicher Schutzausrüstung und der ordnungsgemäßen Abfallentsorgung.