制备纤维蛋白三维支架干细胞培养应用

本实验的总体目标是制备用于培养和诱导多能干细胞（包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）分化的三维纤维蛋白支架。首先制备纤维蛋白原溶液，并进行过夜透析以去除抑制其聚合的分子；随后，在24孔组织培养板的每个孔中聚合形成纤维蛋白的底层基质，完成实验的第二步。

该操作流程的第三步是接种。将由多能干细胞衍生的单个胚胎体接种到支架的基底层上，随后添加第二层纤维蛋白以完成包封。该操作流程的最后一步是向支架中加入适当细胞培养基。

根据具体应用，最终可以获得结果显示，源自多能干细胞的类胚体能够在基于纤维蛋白的三维生物材料支架中成功培养。与传统的二维细胞培养方法相比，该技术的主要优势在于可以在三维环境中观察和调控干细胞的行为。该方法有助于通过筛选影响干细胞行为的化学化合物和生长因子等因子，在三维微环境中回答干细胞生物学的关键问题。纤维蛋白原是一种来源于血液的蛋白质，因此在操作前必须完成相应的安全培训。

首先，将冻干纤维蛋白原从冰箱中取出，静置20分钟使其升至室温。向每个35毫米的培养皿中加入3毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）。称取约100至130毫克纤维蛋白原，均匀撒入各培养皿的TBS液面上。静置5分钟，使纤维蛋白原开始溶解。

然后用盖子盖好培养皿。将培养皿在37摄氏度下孵育2小时，使纤维蛋白原充分溶解。接着用TBS润湿透析管，将透析管底端折叠，并用透析夹夹紧封闭。用移液器将培养皿中的纤维蛋白原溶液转移至透析管中。

然后将透析袋顶端折叠并用透析夹夹紧。将装有纤维蛋白原溶液的透析袋放入一个四升的TBS容器中。混匀溶液。

将搅拌板调至低速，将溶液在搅拌板上透析过夜，至少12小时。在此期间，无需在无菌细胞培养罩内更换T Bs溶液。从透析管中取出纤维蛋白原溶液，并将其转移至锥形管中。

使用5微米注射器滤器过滤纤维蛋白原溶液，以去除溶液中的大颗粒杂质。接着，使用0.22微米滤器将纤维蛋白原溶液过滤并灭菌至50毫升锥形管中。测定总体积后，在280纳米处测定纤维蛋白原溶液的吸光度，通常需要50倍稀释，以获得低于1的吸光度值。

使用以下公式计算纤维蛋白原溶液中蛋白质的浓度：纤维蛋白原的浓度（单位为毫克/毫升）等于280倍的稀释因子除以1.55，其中1.55为人纤维蛋白原在280 nm处的消光系数。接下来，根据初始体积，计算为将溶液中纤维蛋白原浓度稀释至11.1毫克/毫升所需添加的TBS体积。纤维蛋白支架中的最终蛋白质浓度为10毫克/毫升。

聚合后，向24孔板第一行每个孔的右侧加入15微升浓度为每毫升40单位的凝血酶溶液，然后向每个孔的左侧加入15微升50毫摩尔的氯化钙溶液。最后向孔板中加入270微升纤维蛋白原溶液。将孔板前后左右轻轻振荡，以混匀溶液。

让含有混合物的行在室温下聚合五分钟。随着聚合过程进行，支架会逐渐变得不透明。一次制备一行聚合的纤维蛋白原，直至获得所需数量的纤维蛋白支架。最后一次五分钟后，将培养板在37摄氏度下孵育一小时，以使支架完全聚合。当一小时的孵育完成后。

使用20微升移液器挑选单个胚胎体，并将其置于纤维蛋白支架的中央，以实现支架的接种。在显微镜下检查，确保每个孔中仅含有一个胚胎体。在每个胚胎体上方加入5微升凝血酶溶液和5微升50毫摩尔氯化钙溶液，随后向每孔加入90微升纤维蛋白原溶液，溶液应形成一个包裹胚胎体的液滴状结构。

在37摄氏度下额外孵育平板一小时，以确保孵育后的聚合反应完成。向每个孔中加入一毫升适当的细胞培养基，然后将平板放回37摄氏度的培养箱中。此处展示了在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的小鼠诱导性多能干细胞的代表性图像。采用为期八天的视黄酸处理方案，可诱导这些细胞形成类胚体，即包含如图所示神经前体细胞的细胞聚集体。

该图显示了诱导多能干细胞（iPS）来源的胚胎体在三维纤维蛋白支架中培养三天后的形态。此前使用小鼠胚胎干细胞已获得过类似结果。观看本视频后，您应能充分理解如何通过这一为期两天的流程将胚胎体接种到三维纤维蛋白支架中。

请注意，使用纤维蛋白原可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取适当的安全防护措施，包括佩戴个人防护装备以及妥善处理废弃物。