In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

1. Costruzione di Gene Doppia Reporter Fusion
   1. Al fine di eseguire l'imaging bioluminescenza delle cellule staminali embrionali umane, è necessario prima di ottenere cellule che esprimono stabilmente un gene luciferasi giornalista come luciferasi lucciola guidata da un promotore costitutivo come ubiquitina o EF1a.
   2. Il focus di questo protocollo è sulle applicazioni gene reporter, in modo dettagliato le procedure non sono forniti qui. Tuttavia, la strategia generale del nostro laboratorio è quello di utilizzare un doppio vettore costruire fusione che contiene lucciola luciferasi (fluttuazioni) e migliorato proteina verde fluorescente (EGFP) separate da un distanziale all'interno pCDNA 3.1 +.
   3. In breve, il nostro gene di fusione doppio era originariamente situato a valle del promotore del citomegalovirus in pCDNA 3.1 (+), quindi il 3,3 kbp frammento è stato asportato con la digestione e NdeI Noti e smussato-end legatura nel sito di clonazione multiplo di un auto-inattivazione (SIN ) vettori lentivirali, sotto il controllo di un promotore Ubiquitina.
      
      
2. Trasduzione lentivirali
   1. hESC possono essere trasdotte 3-5 giorni dopo il passaggio ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 (titolo virale di circa 107 incubati con 106 celle).
   2. Lo stock scongelato virale possono essere aggiunti direttamente ai media hESC fresca.
   3. Aggiornare i media 12 e 24 ore dopo.
   4. Dopo 48 ore, efficienza di trasduzione in grado di valutare qualitativamente usando la microscopia a fluorescenza. Successivamente, FACS può essere utilizzato per isolare le cellule infette.
      
      
3. HESC coltura e Introduzione alla Imaging Set-up
   1. Cultura tuo hESC luciferasi positivo alimentatore senza condizioni. Noi di solito seguono il protocollo standard WiCell e utilizzare le piastre a 6 e rivestito in fattore di crescita ridotta Matrigel, utilizzando sia i media condizionata o commerciali, senza alimentatore mezzi di comunicazione.
   2. Per rilevare le cellule luciferasi positivo, è necessario avere la sonda giornalista di D-luciferina già preparato. Per fare questo, luciferina aliquota a 1-1,5 ml preparati ad una concentrazione finale di 45 mg / ml. Mantenere le aliquote a -20 ° C, quando non in uso ed evitare l'esposizione alla luce da coprire con un tovagliolo di carta, quando non in deposito.
   3. Al fine di visualizzare le cellule luciferasi positivo, usiamo IVIS 50 e 200 IVIS Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Quest'ultimo sistema comprende un apparato integrato isoflourane e la camera di induzione di anestesia temporanea di piccoli animali.
      
      
4. Nell'imaging bioluminescenza in vitro di hESC
   1. Per nell'imaging bioluminescenza in vitro, è importante mantenere condizioni di sterilità. Pertanto, il sistema di imaging devono essere sterili, preferibilmente in una stanza di coltura cellulare.
   2. Prima di imaging, rimuovere il supporto delle cellule e aggiungere quel tanto che basta PBS per coprire le cellule. Ad esempio, aggiungere 1 ml di PBS a ciascun pozzetto di un 6-pozzetti contenenti vostre culture hESC.
   3. Il rapporto tra D-Luciferin di PBS dovrebbe essere 1:100, quindi aggiungere 10 ml di scongelato D-Luciferin in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
   4. Aspettate un minuto, quindi scattare una foto con un tempo di esposizione di 1 secondo. Se il segnale è debole, aumentare l'intervallo di esposizione e riprovare.
   5. Il segnale bioluminescente riflette numero di cellulare, in modo da saggi di quantificazione può essere effettuata che correlano segnale con il numero di cellule differenti.
      
      
5. Preparazione del mouse e l'iniezione di cellule per imaging in vivo
   1. Reporter gene fornisce un metodo di imaging ad alta velocità, poco costoso e sensibile per le cellule di inseguimento dopo il trapianto per giorni, settimane e anche mesi. Ciò è particolarmente importante in quanto le cellule staminali trapiantate frequente forma teratomi, sono rigettate dal sistema immunitario dell'ospite, o semplicemente morire.
   2. Il metodo più semplice per la formazione di teratomi l'imaging in vivo è quello di iniettare hESC che esprimono il gene reporter luciferasi lucciola nella schiena di topi SCID e di acquisire immagini bioluminescenti con il sistema IVIS.
   3. Quando sei pronto per trapiantare le cellule, l'uso dispasi o collagenasi per allentare le cellule, lavare più volte, e sospendere in una miscela 1:1 di fattore di crescita ridotto matrigel e DMEM. Di solito abbiamo prima mescolare le cellule con DMEM refrigerato e poi aggiungere nel matrigel. Per ciascun sito di iniezione sottocutanea, iniettiamo 200.000 cellule sospese in un volume di 50-100 ul del matrigel / DMEM miscela. Il numero di cellule può essere regolata a seconda dell'applicazione in uso. Ricordate di tenere tutto in ghiaccio prima dell'iniezione.
   4. Una volta che le cellule sono pronte, anestetizzare il mouse inserendo nella casella di induzione con isofluorano flusso acceso. Dopo 1-5 minuti, il mouse è addormentato e può essere posizionato sul tavolo operatorio con isoflurano continuo.
   5. Perché pelliccia naturale auto-fluorescente e può oscurare l'immagine bioluminescente, avremo bisogno di togliere il pelo dalla parte posteriore del mouse. Il modo più semplice per farlo è di utilizzare un rasoio elettrico, ma è anche possibile utilizzare depilazione gel. Pulire con alcool per sterilizzarela pelle dopo
   6. Successivamente, elaborare il vostro sospensione di cellule in una siringa. 23-27 aghi calibro funzionano meglio in quanto non si intasano con le cellule. Se l'ago è troppo grande (<23 gauge) del tratto dell'ago può lasciare un grande buco attraverso il quale le cellule possono refluire fuori.
   7. Iniettare le cellule sotto la pelle nella schiena del mouse. Perché la pelle è piuttosto ampio, con il pollice e l'indice per pizzicare e allungare la zona da iniettare. Iniettare sotto la pelle, facendo attenzione a non forare troppo in profondità. Inoltre, cercare di mantenere l'ago di scivolare fuori del sito di iniezione mentre lo stantuffo: questo impedirà la creazione di un foro nella pelle attraverso i quali le cellule possono perdita se si tenta di iniettare di nuovo.
   8. Dopo che le cellule vengono iniettate, attendere qualche ora per permettere al mouse per svegliarsi e correre prima di ri-anestesia per l'imaging bioluminescenza. In questo modo evita di tossicità isoflurano.
      
      
6. Nell'imaging bioluminescenza in vivo delle cellule trapiantate
   1. Per l'imaging intero bioluminescenza animali, facciamo un'iniezione intraperitoneale di D-luciferina a 375 mg / kg di peso corporeo. Pesare l'animale per calcolare il dosaggio prima dell'iniezione.
   2. Iniettare il D-luciferina nel peritoneo, poco lontano dalla linea mediana. Fare attenzione a non andare troppo in profondità o si può danneggiare gli organi interni. Se il mouse comincia a svegliarsi, metterlo nella scatola eliminazione diretta e attendere un minuto o due. Per i topi, la bioluminescenza massimo si verifica di solito 15-40 minuti dopo l'iniezione.
   3. Ricordati di inserire carta nera opaca nella casella di imaging che aiutano ad assorbire qualsiasi luce non emessa dal hESC. Posizionare il mouse (fino retro) nella camera di imaging con isoflurano, in cima alla carta nera. Inizia con un tempo di esposizione di 10 secondi. Se il segnale è saturo, provare a diminuire il tempo di esposizione, se troppo debole, aumentare l'esposizione.
   4. Una volta che il tempo di esposizione del segnale è stato ottimizzato per il mouse, cominciare a prendere le immagini ogni minuto fino a quando il segnale raggiunge un massimo. Questo è fatto meglio utilizzando il software di imaging per selezionare "regioni di interesse (ROI)" che coprono le sedi di iniezione. Attraverso il monitoraggio della intensità del segnale in ogni ROI si può facilmente determinare quando il segnale comincia a diminuire, indica che l'intensità del segnale massimo è stato raggiunto. Il segnale di massima dovrebbero essere usati come dati finali.
   5. Quando si è soddisfatti con le vostre immagini, togliere il mouse da isoflurano e permettergli di svegliarsi nella sua gabbia. Di solito, il mouse dovrebbe svegliarsi in 15 minuti.
   6. Giornalista di imaging bioluminescenza gene può essere ripetuta ogni giorno, settimanali e mensili per tutto il tempo la hESC sopravvivere l'animale. Segnale da un teratoma sviluppo aumenterà in modo esponenziale nel corso del tempo, tipicamente dell'ordine di settimane, come il hESC cominciano a proliferare.
   7. Dopo il periodo di tempo desiderato di immagini bioluminescenza è acquisito, l'animale può essere sacrificata e sezioni di tessuto utilizzato per l'esame istologico.

Rispetto ad altre modalità come la PET e risonanza magnetica, la bioluminescenza è limitata risoluzione spaziale e di penetrazione nel tessuto ridotto a causa della relativamente debole energia dei fotoni emessi (2-3 eV), per queste ragioni che finora non è stato applicabile in animali di grandi dimensioni. Tuttavia, bioluminescenza ha il vantaggio di essere a basso costo, ad alta produttività, e non invasivo, il che rende altamente auspicabile che in cellule staminali in vivo inseguimento nei piccoli animali. Non bioluminescenza geni reporter come costruisce PET e fluorescenza può essere utilizzato in combinazione con luciferasi per creare un gene reporter di fusione che si compone di diversi domini contenenti i geni giornalista individuali. Per esempio, il nostro gruppo utilizza una fusione costruire contenente fluttuazioni, monomerico proteina fluorescente rossa (MRFP) e herpes simplex virus troncato timidina chinasi (TTK, un gene reporter PET) per il multi-modalità di tracciamento del comportamento delle cellule staminali nei piccoli animali. Nel corso del tempo, geni reporter stabilmente integrato può essere soggetto a silenziamento genico dalla macchina endogena cromosomica. Suscettibilità Un gene reporter di silenziamento genico è strettamente legato alla scelta del promotore guida la sua espressione. Per esempio, il promotore del citomegalovirus (pCMV) è rapidamente messo a tacere in hESC. Il nostro laboratorio ha avuto un buon successo con l'uomo ubiquitina C-promotore (pube) per guidare l'espressione di una fusione costrutto doppie in più linee di cellule hESC, e hanno osservato una minima perdita di segnale nel tempo.

In conclusione, prima di hESC derivate rigenerazione cellulare diventa clinicamente rilevante, diversi ostacoli biologici di base devono essere superate - e cioè la morte cellulare o apoptosi in seguito al trapianto di cellule differenziate, formazione teratoma da cellule indifferenziate, e il rigetto immunitario dell'organismo ospite. Queste ed altre sfide evidenziano la necessità di attecchimento hESC inseguimento, la sopravvivenza e la proliferazione all'interno dell'organismo ricevente. Lo sviluppo di tecniche di imaging molecolare come il gene reporter luciferasi lucciola e ultra sensibile CCD ha permesso non invasiva, la valutazione ripetitiva di posizione delle cellule, la migrazione, proliferazione e differenziazione in vivo. Tecnologie come queste aiuterà traduzione spinta della biologia hESC dal laboratorio verso le applicazioni cliniche.