How does HPLC separate components in a liquid mixture?

HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.

What is the difference between analytical and preparative HPLC?

Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.

Why is degassing the mobile phase important in HPLC?

Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.

What does the chromatogram tell you about separated components?

A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.

What is reversed-phase chromatography and when is it used?

Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.

How does gradient elution improve HPLC separation?

Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.

Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?

HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.

كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC)

0 مشاهدة12:58 دقيقة

1. صنع مرحلة الهاتف المحمول

قم بإعداد المرحلة المتنقلة عن طريق إضافة 400 مل من الأسيتونيتريل إلى ما يقرب من 1.5 لتر من ماء DI النقي.
أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي إلى هذا المحلول.
بتخفيف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2.0 لتر في قارورة حجمية بماء DI النقي. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 إلى 3.2.
اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ من هيدروكسيد الصوديوم ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي المعاير. أضف ببطء شديد بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني إلى 4.0. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 قطرة لإنجازها.
قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء نايلون 66 0.47 ميكرومتر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود الكروماتوجرافي. من المهم تفريغ الطور المتحرك لتجنب وجود فقاعة ، والتي يمكن أن تسبب إما فراغا في المرحلة الثابتة عند مدخل العمود أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف ، مما يتسبب في عدم استقرار امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.

2. إنشاء حلول المكونات

المكونات الثلاثة التي يجب تصنيعها هي الكافيين (0.8 مجم / مل) ، بنزوات البوتاسيوم (1.4 مجم / مل) ، والأسبارتام (L-aspartyl-L-فينيل ألانين ميثيل إستر) (6.0 مجم / مل). هذه التركيزات ، بمجرد تخفيفها بنفس الطريقة ، تضع المعايير عند المستويات الموجودة في عينات الصودا.

أضف 0.40 جم من الكافيين إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
أضف 0.70 جم من البنزوات إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
أضف 0.60 جم من الأسبارتام إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بماء DI. ضع هذا المحلول في الثلاجة لتجنب التحلل أثناء التخزين.

3. صنع 7 حلول قياسية

المكونات الثلاثة لها معاملات توزيع مختلفة ، مما يؤثر على كيفية تفاعل كل منها مع كلتا المرحلتين. كلما زاد معامل التوزيع ، زاد الوقت الذي يقضيه المكون في المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ أطول في الوصول إلى الكاشف.

باتباع الرسم البياني في الجدول 1 ، قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية سعة 50 مل.
قم بتخفيف كل من حلول المخزون إلى علامة 50 مل على القوارير الحجمية ذات الطور المتنقل.
صب كل محلول قياسي في قوارير صغيرة مصنفة في رف عينة.
قم بتخزين رفوف العينات في الثلاجة ، جنبا إلى جنب مع المحاليل المتبقية في قوارير حجمية سعة 50 مل.

4. التحقق من الإعدادات الأولية لنظام HPLC

تأكد من أن خط النفايات موجود في حاوية نفايات ولا يتم إعادة تدويره مرة أخرى إلى المرحلة المتنقلة.
تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. هذا مرتفع بما يكفي للسماح لجميع القمم بالتخلي في غضون 5 دقائق وبطيء بما يكفي للسماح بدقة جيدة.
تحقق من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق على القيم الصحيحة على اللوحة الأمامية لنظام توصيل المذيبات (المضخة).
1. الحد الأدنى لإعداد الضغط: 250 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لإغلاق المضخة ، في حالة حدوث تسرب).
2. إعداد الضغط الأقصى: 4,000 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لحماية المضخة من الانكسار ، في حالة تشكل انسداد).
اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشف لضبط الفراغ (الفراغ هو المرحلة المتنقلة النقية).
اشطف حقنة سعة 100 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من أحد معايير العمل المراد تحليلها ، واملأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون ، مما يسمح بتحديد ذروة كل مكون محل اهتمام.

5. حقن العينة وجمع البيانات يدويا

مع وجود مقبض الحاقن في وضع التحميل ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول ببطء من خلال منفذ الحاجز.
تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يتيح وقتا كافيا لجميع القمم الثلاثة لتمريرها عبر الكاشف.
عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن (الذي يحقن العينة في المرحلة المحمولة) وانقر فوق "بدء التجربة" في برنامج جمع بيانات الكمبيوتر على الفور. بالنسبة للمعايير 1-3 ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة المتسلسلة على الشاشة أثناء التشغيل (الشكل 1).
بمجرد مرور 300 ثانية ، يرسل جمع البيانات مطالبة لحفظ ملف البيانات. احفظ البيانات تحت اسم ملف مناسب (على سبيل المثال ، STD # 1).
لاحظ الوقت بالثواني لذروة كل تجربة ، والذي يستخدم في تحديد هذا المكون.
قم بإزالة المحقنة من الحاجز وكرر العملية لكل من معايير العمل المتبقية ، باستخدام نفس الوقت لكل مخطط كروماتوغرام كما هو محدد من التشغيل الأول.

الشكل 1. الكروماتوجرام للمكونات الثلاثة. من اليسار إلى اليمين ، فهي الكافيين والأسبارتام والبنزوات. 6. عينات المشروبات الغازية الدايت

Diet Coke و Diet Pepsi و Coke Zero هي "المجهولة". لقد تركوا في حاويات مفتوحة طوال الليل للتخلص من الكربنة ، لأن الفقاعات ليست جيدة لنظام HPLC. هذا يتخلص بشكل كاف من أي غازات في العينات.

ارسم حوالي 2 مل من صودا الدايت في حقنة بلاستيكية.
قم بتوصيل طرف الفلتر بالمحقنة عبر Luer-Lok عن طريق لفها في مكانها.
ادفع السائل الموجود في المحقنة عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية صغيرة. هذا يتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد عمود الفصل.
خفف كل عينة بكمية متساوية من ماء DI ، بحيث تكون بدرجة نقاء 50٪.
حقن 100 ميكرولتر من العينة في حلقة العينة ، وقم بإجراء تجارب بنفس المعلمات الخاصة بالمعايير.

7. الحسابات

من تركيزات المحاليل المكونة ، احسب تركيز جميع المكونات في المعايير ، بناء على التخفيفات التي تم إجراؤها للعينات ال 7.
حدد مناطق الذروة على الكروماتوغرام لكل معيار والعينات غير المعروفة بالطريقة المثلثة ، والتي تساوي ارتفاع الذروة مضروبا في العرض عند 1/2 ارتفاع (الشكل 2). بعد تحديد الذروة التي تتوافق مع كل مكون بناء على الوقت الذي يستغرقه كل مكون لإظهار الذروة الخاصة به ، أدخل مناطق الذروة هذه في جدول بيانات الكمبيوتر.
قم بإنشاء منحنيات معايرة لمنطقة الذروة مقابل التركيز (ملغم / لتر) في معايير المكونات الثلاثة.
حدد المربعات الأقل المناسبة لكل منحنى معايرة.
احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة الموضحة في تجارب HPLC للعينات. تذكر أن صودا الدايت تم تخفيفها بمعامل 2 قبل حقنها في نظام HPLC.
احسب الكمية ، بالملغم / لتر ، لكل مكون في المشروبات الغازية الدايت.
بناء على النتائج ، احسب المليغرام من كل مكون موجود في علبة صودا سعة 12 أونصة. افترض أن 12 أونصة = 354.9 مل.