كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC)

1. صنع مرحلة الهاتف المحمول

1. قم بإعداد المرحلة المتنقلة عن طريق إضافة 400 مل من الأسيتونيتريل إلى ما يقرب من 1.5 لتر من ماء DI النقي.
2. أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي إلى هذا المحلول.
قم
3. بتخفيف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2.0 لتر في قارورة حجمية بماء DI النقي. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 إلى 3.2.
4. اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ من هيدروكسيد الصوديوم ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي المعاير. أضف ببطء شديد بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني إلى 4.0. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 قطرة لإنجازها.
5. قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء نايلون 66 0.47 ميكرومتر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود الكروماتوجرافي. من المهم تفريغ الطور المتحرك لتجنب وجود فقاعة ، والتي يمكن أن تسبب إما فراغا في المرحلة الثابتة عند مدخل العمود أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف ، مما يتسبب في عدم استقرار امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.

2. إنشاء حلول المكونات

< p class = "jove_content">المكونات الثلاثة التي يجب تصنيعها هي الكافيين (0.8 مجم / مل) ، بنزوات البوتاسيوم (1.4 مجم / مل) ، والأسبارتام (L-aspartyl-L-فينيل ألانين ميثيل إستر) (6.0 مجم / مل). هذه التركيزات ، بمجرد تخفيفها بنفس الطريقة ، تضع المعايير عند المستويات الموجودة في عينات الصودا.

1. أضف 0.40 جم من الكافيين إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
2. أضف 0.70 جم من البنزوات إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
3. أضف 0.60 جم من الأسبارتام إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بماء DI. ضع هذا المحلول في الثلاجة لتجنب التحلل أثناء التخزين.

< p class = "jove_title" >3. صنع 7 حلول قياسية

المكونات الثلاثة لها معاملات توزيع مختلفة ، مما يؤثر على كيفية تفاعل كل منها مع كلتا المرحلتين. كلما زاد معامل التوزيع ، زاد الوقت الذي يقضيه المكون في المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ أطول في الوصول إلى الكاشف.

1. باتباع الرسم البياني في الجدول 1 ، قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية سعة 50 مل.
2. قم بتخفيف كل من حلول المخزون إلى علامة 50 مل على القوارير الحجمية ذات الطور المتنقل.
3. صب كل محلول قياسي في قوارير صغيرة مصنفة في رف عينة.
4. قم بتخزين رفوف العينات في الثلاجة ، جنبا إلى جنب مع المحاليل المتبقية في قوارير حجمية سعة 50 مل.

4. التحقق من الإعدادات الأولية لنظام HPLC

1. تأكد من أن خط النفايات موجود في حاوية نفايات ولا يتم إعادة تدويره مرة أخرى إلى المرحلة المتنقلة.
2. تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. هذا مرتفع بما يكفي للسماح لجميع القمم بالتخلي في غضون 5 دقائق وبطيء بما يكفي للسماح بدقة جيدة.
3. تحقق من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق على القيم الصحيحة على اللوحة الأمامية لنظام توصيل المذيبات (المضخة).
   1. الحد الأدنى لإعداد الضغط: 250 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لإغلاق المضخة ، في حالة حدوث تسرب).
   2. إعداد الضغط الأقصى: 4,000 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لحماية المضخة من الانكسار ، في حالة تشكل انسداد).
4. اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشف لضبط الفراغ (الفراغ هو المرحلة المتنقلة النقية).
5. اشطف حقنة سعة 100 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من أحد معايير العمل المراد تحليلها ، واملأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون ، مما يسمح بتحديد ذروة كل مكون محل اهتمام.

5. حقن العينة وجمع البيانات يدويا

1. مع وجود مقبض الحاقن في وضع التحميل ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول ببطء من خلال منفذ الحاجز.
2. تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يتيح وقتا كافيا لجميع القمم الثلاثة لتمريرها عبر الكاشف.
3. عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن (الذي يحقن العينة في المرحلة المحمولة) وانقر فوق "بدء التجربة" في برنامج جمع بيانات الكمبيوتر على الفور. بالنسبة للمعايير 1-3 ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة المتسلسلة على الشاشة أثناء التشغيل (الشكل 1).
4. بمجرد مرور 300 ثانية ، يرسل جمع البيانات مطالبة لحفظ ملف البيانات. احفظ البيانات تحت اسم ملف مناسب (على سبيل المثال ، STD # 1).
5. لاحظ الوقت بالثواني لذروة كل تجربة ، والذي يستخدم في تحديد هذا المكون.
6. قم بإزالة المحقنة من الحاجز وكرر العملية لكل من معايير العمل المتبقية ، باستخدام نفس الوقت لكل مخطط كروماتوغرام كما هو محدد من التشغيل الأول.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. الكروماتوجرام للمكونات الثلاثة. من اليسار إلى اليمين ، فهي الكافيين والأسبارتام والبنزوات. < p class = "jove_title" >6. عينات المشروبات الغازية الدايت

Diet Coke و Diet Pepsi و Coke Zero هي "المجهولة". لقد تركوا في حاويات مفتوحة طوال الليل للتخلص من الكربنة ، لأن الفقاعات ليست جيدة لنظام HPLC. هذا يتخلص بشكل كاف من أي غازات في العينات.

1. ارسم حوالي 2 مل من صودا الدايت في حقنة بلاستيكية.
2. قم بتوصيل طرف الفلتر بالمحقنة عبر Luer-Lok عن طريق لفها في مكانها.
3. ادفع السائل الموجود في المحقنة عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية صغيرة. هذا يتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد عمود الفصل.
4. خفف كل عينة بكمية متساوية من ماء DI ، بحيث تكون بدرجة نقاء 50٪.
5. حقن 100 ميكرولتر من العينة في حلقة العينة ، وقم بإجراء تجارب بنفس المعلمات الخاصة بالمعايير.

7. الحسابات

1. من تركيزات المحاليل المكونة ، احسب تركيز جميع المكونات في المعايير ، بناء على التخفيفات التي تم إجراؤها للعينات ال 7.
2. حدد مناطق الذروة على الكروماتوغرام لكل معيار والعينات غير المعروفة بالطريقة المثلثة ، والتي تساوي ارتفاع الذروة مضروبا في العرض عند 1/2 ارتفاع (الشكل 2). بعد تحديد الذروة التي تتوافق مع كل مكون بناء على الوقت الذي يستغرقه كل مكون لإظهار الذروة الخاصة به ، أدخل مناطق الذروة هذه في جدول بيانات الكمبيوتر.
3. قم بإنشاء منحنيات معايرة لمنطقة الذروة مقابل التركيز (ملغم / لتر) في معايير المكونات الثلاثة.
4. حدد المربعات الأقل المناسبة لكل منحنى معايرة.
5. احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة الموضحة في تجارب HPLC للعينات. تذكر أن صودا الدايت تم تخفيفها بمعامل 2 قبل حقنها في نظام HPLC.
6. احسب الكمية ، بالملغم / لتر ، لكل مكون في المشروبات الغازية الدايت.
7. بناء على النتائج ، احسب المليغرام من كل مكون موجود في علبة صودا سعة 12 أونصة. افترض أن 12 أونصة = 354.9 مل.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2. مثال أساسي لذروة ارتفاع المنحنى وعرضه ، والتي يجب ضربها (ارتفاع الذروة مضروبة في العرض عند 1/2 ارتفاع).