1. صنع مرحلة الهاتف المحمول
- قم بإعداد المرحلة المتنقلة عن طريق إضافة 400 مل من الأسيتونيتريل إلى ما يقرب من 1.5 لتر من ماء DI النقي.
- أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي إلى هذا المحلول. قم
- بتخفيف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2.0 لتر في قارورة حجمية بماء DI النقي. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 إلى 3.2.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ من هيدروكسيد الصوديوم ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي المعاير. أضف ببطء شديد بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني إلى 4.0. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 قطرة لإنجازها.
- قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء نايلون 66 0.47 ميكرومتر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود الكروماتوجرافي. من المهم تفريغ الطور المتحرك لتجنب وجود فقاعة ، والتي يمكن أن تسبب إما فراغا في المرحلة الثابتة عند مدخل العمود أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف ، مما يتسبب في عدم استقرار امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
2. إنشاء حلول المكونات
< p class = "jove_content">المكونات الثلاثة التي يجب تصنيعها هي الكافيين (0.8 مجم / مل) ، بنزوات البوتاسيوم (1.4 مجم / مل) ، والأسبارتام (L-aspartyl-L-فينيل ألانين ميثيل إستر) (6.0 مجم / مل). هذه التركيزات ، بمجرد تخفيفها بنفس الطريقة ، تضع المعايير عند المستويات الموجودة في عينات الصودا.- أضف 0.40 جم من الكافيين إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.70 جم من البنزوات إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.60 جم من الأسبارتام إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بماء DI. ضع هذا المحلول في الثلاجة لتجنب التحلل أثناء التخزين.
المكونات الثلاثة لها معاملات توزيع مختلفة ، مما يؤثر على كيفية تفاعل كل منها مع كلتا المرحلتين. كلما زاد معامل التوزيع ، زاد الوقت الذي يقضيه المكون في المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ أطول في الوصول إلى الكاشف.
- باتباع الرسم البياني في الجدول 1 ، قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية سعة 50 مل.
- قم بتخفيف كل من حلول المخزون إلى علامة 50 مل على القوارير الحجمية ذات الطور المتنقل.
- صب كل محلول قياسي في قوارير صغيرة مصنفة في رف عينة.
- قم بتخزين رفوف العينات في الثلاجة ، جنبا إلى جنب مع المحاليل المتبقية في قوارير حجمية سعة 50 مل.
4. التحقق من الإعدادات الأولية لنظام HPLC
- تأكد من أن خط النفايات موجود في حاوية نفايات ولا يتم إعادة تدويره مرة أخرى إلى المرحلة المتنقلة.
- تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. هذا مرتفع بما يكفي للسماح لجميع القمم بالتخلي في غضون 5 دقائق وبطيء بما يكفي للسماح بدقة جيدة.
- تحقق من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق على القيم الصحيحة على اللوحة الأمامية لنظام توصيل المذيبات (المضخة).
- الحد الأدنى لإعداد الضغط: 250 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لإغلاق المضخة ، في حالة حدوث تسرب).
- إعداد الضغط الأقصى: 4,000 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لحماية المضخة من الانكسار ، في حالة تشكل انسداد).
- اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشف لضبط الفراغ (الفراغ هو المرحلة المتنقلة النقية).
- اشطف حقنة سعة 100 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من أحد معايير العمل المراد تحليلها ، واملأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون ، مما يسمح بتحديد ذروة كل مكون محل اهتمام.
5. حقن العينة وجمع البيانات يدويا
- مع وجود مقبض الحاقن في وضع التحميل ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول ببطء من خلال منفذ الحاجز.
- تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يتيح وقتا كافيا لجميع القمم الثلاثة لتمريرها عبر الكاشف.
- عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن (الذي يحقن العينة في المرحلة المحمولة) وانقر فوق "بدء التجربة" في برنامج جمع بيانات الكمبيوتر على الفور. بالنسبة للمعايير 1-3 ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة المتسلسلة على الشاشة أثناء التشغيل (الشكل 1).
- بمجرد مرور 300 ثانية ، يرسل جمع البيانات مطالبة لحفظ ملف البيانات. احفظ البيانات تحت اسم ملف مناسب (على سبيل المثال ، STD # 1).
- لاحظ الوقت بالثواني لذروة كل تجربة ، والذي يستخدم في تحديد هذا المكون.
- قم بإزالة المحقنة من الحاجز وكرر العملية لكل من معايير العمل المتبقية ، باستخدام نفس الوقت لكل مخطط كروماتوغرام كما هو محدد من التشغيل الأول.
الشكل 1. الكروماتوجرام للمكونات الثلاثة. من اليسار إلى اليمين ، فهي الكافيين والأسبارتام والبنزوات. < p class = "jove_title" >6. عينات المشروبات الغازية الدايت
Diet Coke و Diet Pepsi و Coke Zero هي "المجهولة". لقد تركوا في حاويات مفتوحة طوال الليل للتخلص من الكربنة ، لأن الفقاعات ليست جيدة لنظام HPLC. هذا يتخلص بشكل كاف من أي غازات في العينات.
- ارسم حوالي 2 مل من صودا الدايت في حقنة بلاستيكية.
- قم بتوصيل طرف الفلتر بالمحقنة عبر Luer-Lok عن طريق لفها في مكانها.
- ادفع السائل الموجود في المحقنة عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية صغيرة. هذا يتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد عمود الفصل.
- خفف كل عينة بكمية متساوية من ماء DI ، بحيث تكون بدرجة نقاء 50٪.
- حقن 100 ميكرولتر من العينة في حلقة العينة ، وقم بإجراء تجارب بنفس المعلمات الخاصة بالمعايير.
7. الحسابات
- من تركيزات المحاليل المكونة ، احسب تركيز جميع المكونات في المعايير ، بناء على التخفيفات التي تم إجراؤها للعينات ال 7.
- حدد مناطق الذروة على الكروماتوغرام لكل معيار والعينات غير المعروفة بالطريقة المثلثة ، والتي تساوي ارتفاع الذروة مضروبا في العرض عند 1/2 ارتفاع (الشكل 2). بعد تحديد الذروة التي تتوافق مع كل مكون بناء على الوقت الذي يستغرقه كل مكون لإظهار الذروة الخاصة به ، أدخل مناطق الذروة هذه في جدول بيانات الكمبيوتر.
- قم بإنشاء منحنيات معايرة لمنطقة الذروة مقابل التركيز (ملغم / لتر) في معايير المكونات الثلاثة.
- حدد المربعات الأقل المناسبة لكل منحنى معايرة.
- احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة الموضحة في تجارب HPLC للعينات. تذكر أن صودا الدايت تم تخفيفها بمعامل 2 قبل حقنها في نظام HPLC.
- احسب الكمية ، بالملغم / لتر ، لكل مكون في المشروبات الغازية الدايت.
- بناء على النتائج ، احسب المليغرام من كل مكون موجود في علبة صودا سعة 12 أونصة. افترض أن 12 أونصة = 354.9 مل.
الشكل 2. مثال أساسي لذروة ارتفاع المنحنى وعرضه ، والتي يجب ضربها (ارتفاع الذروة مضروبة في العرض عند 1/2 ارتفاع).
المصدر: د. بول باور - جامعة بوردو
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي طريقة تحليلية مهمة شائعة الاستخدام لفصل مكونات العينات السائلة وتحديدها. في هذه التقنية ، يتم ضخ محلول (المرحلة الأولى) من خلال عمود يحتوي على عبوة من الجسيمات المسامية الصغيرة مع مرحلة ثانية مرتبطة بالسطح. تؤدي قابلية الذوبان المختلفة لمكونات العينة في المرحلتين إلى تحرك المكونات عبر العمود بسرعات متوسطة مختلفة ، مما يؤدي إلى فصل هذه المكونات. يسمى المحلول الذي يتم ضخه بالمرحلة المتنقلة ، بينما تسمى المرحلة الموجودة في العمود بالمرحلة الثابتة.
هناك عدة أوضاع للكروماتوغرافيا السائلة ، اعتمادا على نوع المرحلة الثابتة و / أو المتحركة المستخدمة. تستخدم هذه التجربة كروماتوغرافيا الطور العكسي ، حيث تكون المرحلة الثابتة غير قطبية ، وتكون المرحلة المتحركة قطبية. المرحلة الثابتة التي سيتم استخدامها هي مجموعات هيدروكربونية C18 مرتبطة بجزيئات السيليكا 3 ميكرومتر ، في حين أن المرحلة المتحركة عبارة عن مخزن مؤقت مائي مع معدل عضوي قطبي (أسيتونيتريل) يضاف لتغيير قوته المميضة. في هذا النموذج ، يمكن استخدام السيليكا للعينات القابلة للذوبان في الماء ، مما يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات. في هذه التجربة ، يتم فصل مخاليط من ثلاثة مكونات توجد بشكل متكرر في المشروبات الغازية للدايت (وهي الكافيين والبنزوات والأسبارتام). يتم استخدام سبعة محاليل محضرة تحتوي على كميات معروفة من الأنواع الثلاثة ، ثم يتم تسجيل كروماتوجرامياتها.
1. صنع مرحلة الهاتف المحمول
- قم بإعداد المرحلة المتنقلة عن طريق إضافة 400 مل من الأسيتونيتريل إلى ما يقرب من 1.5 لتر من ماء DI النقي.
- أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي إلى هذا المحلول. قم
- بتخفيف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2.0 لتر في قارورة حجمية بماء DI النقي. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 إلى 3.2.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ من هيدروكسيد الصوديوم ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي المعاير. أضف ببطء شديد بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني إلى 4.0. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 قطرة لإنجازها.
- قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء نايلون 66 0.47 ميكرومتر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود الكروماتوجرافي. من المهم تفريغ الطور المتحرك لتجنب وجود فقاعة ، والتي يمكن أن تسبب إما فراغا في المرحلة الثابتة عند مدخل العمود أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف ، مما يتسبب في عدم استقرار امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
2. إنشاء حلول المكونات
< p class = "jove_content">المكونات الثلاثة التي يجب تصنيعها هي الكافيين (0.8 مجم / مل) ، بنزوات البوتاسيوم (1.4 مجم / مل) ، والأسبارتام (L-aspartyl-L-فينيل ألانين ميثيل إستر) (6.0 مجم / مل). هذه التركيزات ، بمجرد تخفيفها بنفس الطريقة ، تضع المعايير عند المستويات الموجودة في عينات الصودا.- أضف 0.40 جم من الكافيين إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.70 جم من البنزوات إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.60 جم من الأسبارتام إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بماء DI. ضع هذا المحلول في الثلاجة لتجنب التحلل أثناء التخزين.
المكونات الثلاثة لها معاملات توزيع مختلفة ، مما يؤثر على كيفية تفاعل كل منها مع كلتا المرحلتين. كلما زاد معامل التوزيع ، زاد الوقت الذي يقضيه المكون في المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ أطول في الوصول إلى الكاشف.
- باتباع الرسم البياني في الجدول 1 ، قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية سعة 50 مل.
- قم بتخفيف كل من حلول المخزون إلى علامة 50 مل على القوارير الحجمية ذات الطور المتنقل.
- صب كل محلول قياسي في قوارير صغيرة مصنفة في رف عينة.
- قم بتخزين رفوف العينات في الثلاجة ، جنبا إلى جنب مع المحاليل المتبقية في قوارير حجمية سعة 50 مل.
4. التحقق من الإعدادات الأولية لنظام HPLC
- تأكد من أن خط النفايات موجود في حاوية نفايات ولا يتم إعادة تدويره مرة أخرى إلى المرحلة المتنقلة.
- تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. هذا مرتفع بما يكفي للسماح لجميع القمم بالتخلي في غضون 5 دقائق وبطيء بما يكفي للسماح بدقة جيدة.
- تحقق من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق على القيم الصحيحة على اللوحة الأمامية لنظام توصيل المذيبات (المضخة).
- الحد الأدنى لإعداد الضغط: 250 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لإغلاق المضخة ، في حالة حدوث تسرب).
- إعداد الضغط الأقصى: 4,000 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لحماية المضخة من الانكسار ، في حالة تشكل انسداد).
- اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشف لضبط الفراغ (الفراغ هو المرحلة المتنقلة النقية).
- اشطف حقنة سعة 100 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من أحد معايير العمل المراد تحليلها ، واملأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون ، مما يسمح بتحديد ذروة كل مكون محل اهتمام.
5. حقن العينة وجمع البيانات يدويا
- مع وجود مقبض الحاقن في وضع التحميل ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول ببطء من خلال منفذ الحاجز.
- تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يتيح وقتا كافيا لجميع القمم الثلاثة لتمريرها عبر الكاشف.
- عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن (الذي يحقن العينة في المرحلة المحمولة) وانقر فوق "بدء التجربة" في برنامج جمع بيانات الكمبيوتر على الفور. بالنسبة للمعايير 1-3 ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة المتسلسلة على الشاشة أثناء التشغيل (الشكل 1).
- بمجرد مرور 300 ثانية ، يرسل جمع البيانات مطالبة لحفظ ملف البيانات. احفظ البيانات تحت اسم ملف مناسب (على سبيل المثال ، STD # 1).
- لاحظ الوقت بالثواني لذروة كل تجربة ، والذي يستخدم في تحديد هذا المكون.
- قم بإزالة المحقنة من الحاجز وكرر العملية لكل من معايير العمل المتبقية ، باستخدام نفس الوقت لكل مخطط كروماتوغرام كما هو محدد من التشغيل الأول.
الشكل 1. الكروماتوجرام للمكونات الثلاثة. من اليسار إلى اليمين ، فهي الكافيين والأسبارتام والبنزوات. < p class = "jove_title" >6. عينات المشروبات الغازية الدايت
Diet Coke و Diet Pepsi و Coke Zero هي "المجهولة". لقد تركوا في حاويات مفتوحة طوال الليل للتخلص من الكربنة ، لأن الفقاعات ليست جيدة لنظام HPLC. هذا يتخلص بشكل كاف من أي غازات في العينات.
- ارسم حوالي 2 مل من صودا الدايت في حقنة بلاستيكية.
- قم بتوصيل طرف الفلتر بالمحقنة عبر Luer-Lok عن طريق لفها في مكانها.
- ادفع السائل الموجود في المحقنة عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية صغيرة. هذا يتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد عمود الفصل.
- خفف كل عينة بكمية متساوية من ماء DI ، بحيث تكون بدرجة نقاء 50٪.
- حقن 100 ميكرولتر من العينة في حلقة العينة ، وقم بإجراء تجارب بنفس المعلمات الخاصة بالمعايير.
7. الحسابات
- من تركيزات المحاليل المكونة ، احسب تركيز جميع المكونات في المعايير ، بناء على التخفيفات التي تم إجراؤها للعينات ال 7.
- حدد مناطق الذروة على الكروماتوغرام لكل معيار والعينات غير المعروفة بالطريقة المثلثة ، والتي تساوي ارتفاع الذروة مضروبا في العرض عند 1/2 ارتفاع (الشكل 2). بعد تحديد الذروة التي تتوافق مع كل مكون بناء على الوقت الذي يستغرقه كل مكون لإظهار الذروة الخاصة به ، أدخل مناطق الذروة هذه في جدول بيانات الكمبيوتر.
- قم بإنشاء منحنيات معايرة لمنطقة الذروة مقابل التركيز (ملغم / لتر) في معايير المكونات الثلاثة.
- حدد المربعات الأقل المناسبة لكل منحنى معايرة.
- احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة الموضحة في تجارب HPLC للعينات. تذكر أن صودا الدايت تم تخفيفها بمعامل 2 قبل حقنها في نظام HPLC.
- احسب الكمية ، بالملغم / لتر ، لكل مكون في المشروبات الغازية الدايت.
- بناء على النتائج ، احسب المليغرام من كل مكون موجود في علبة صودا سعة 12 أونصة. افترض أن 12 أونصة = 354.9 مل.
الشكل 2. مثال أساسي لذروة ارتفاع المنحنى وعرضه ، والتي يجب ضربها (ارتفاع الذروة مضروبة في العرض عند 1/2 ارتفاع).
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، أو HPLC ، هي تقنية متعددة الاستخدامات تفصل مكونات الخليط السائل بناء على تفاعلاتها المختلفة مع الطور الثابت.
HPLC هو تكيف لكروماتوغرافيا العمود. في كروماتوغرافيا العمود ، يكون العمود مليئا بخرز دقيق النطاق يسمى المرحلة الثابتة. تعمل حبات الطور الثابتة مع مجموعات كيميائية تحفز التفاعل بين الخرزة ومكونات الخليط الموجود في الطور السائل أو المتحرك. عندما يتدفق الخليط عبر العمود ، تتفاعل المكونات مع المرحلة الثابتة بشكل مختلف.
في HPLC ، يتم إجراء كروماتوغرافيا العمود بمعدل تدفق أعلى ، وبالتالي ضغط أعلى ، من كروماتوغرافيا العمود الكلاسيكية. يتيح ذلك استخدام حبات الطور الثابتة الأصغر مع مساحة سطح أكبر إلى نسبة الحجم ، مما يزيد بشكل كبير من تفاعل الطور الثابت والمكونات في المرحلة المتنقلة.
سيقدم هذا الفيديو أساسيات تشغيل HPLC من خلال إظهار فصل مكونات المشروبات الغازية الدايت المختلفة.
هناك نوعان من HPLC المستخدمة في المختبر: تحليلي وتحضيري. في HPLC التحليلي ، يتم استخدام الأداة لتحديد مكونات الحجم الصغير ، ثم يتم التخلص من العينة التي تم تحليلها كنفايات. في HPLC التحضيري ، يتم استخدام الأداة لتنقية الخليط ويتم جمع الكمية المطلوبة من كل مكون في كسور.
تتكون أجهزة HPLC من سلسلة من المكونات البسيطة. أولا ، يتم ضخ المرحلة المتنقلة ، الموجودة في خزانات المذيبات ، عبر النظام بواسطة مضخة واحدة أو أكثر بمعدل تدفق ثابت. يتم حقن العينة في تيار الطور المتحرك بواسطة حاقن العينة. ثم يتم تسليم العينة ، المخففة بواسطة المرحلة المتنقلة ، إلى عمود HPLC ، حيث يتم فصل مكونات العينة. ثم يتم تحليل المكونات بواسطة الكاشف ، وإما حفظها في أجزاء لاستخدامها لاحقا ، أو نقلها إلى زجاجة نفايات.
عمود HPLC هو المكون الرئيسي للنظام. وهي تتألف من أسطوانة معدنية أو بلاستيكية ، معبأة بخرز دقيق الحجم من الطور الثابت ، أو راتنج الكروماتوغرافيا. يتدفق خليط العينة عبر طبقة الجسيمات المعبأة بمعدل تدفق ثابت ويتفاعل كل مكون مع المرحلة الثابتة أثناء تدفقه.
تتفاعل المركبات مع المرحلة الثابتة بشكل مختلف ، وبالتالي تنتقل على طول العمود إلى الكاشف بمعدل مختلف. يسمى الوقت المطلوب لأحد المكونات للخروج من العمود ، أو الملح ، وقت الاستبقاء. والنتيجة هي مخطط لوقت الاحتفاظ مقابل الشدة ، أو مخطط كروماتوغرام. يتم استخدام وقت الاستبقاء لتحديد المكون. يتم استخدام حجم الذروة ، وتحديدا المنطقة الواقعة تحت الذروة ، لتحديد كمية المركب في المحلول الأولي.
يعتمد اختيار المرحلة الثابتة على خصائص المكونات في خليط العينة. المرحلة الثابتة الأكثر استخداما هي حبات السيليكا ، لأنها مادة خاملة غير قطبية تشكل حبات صغيرة الحجم ، وتحقق كثافة تعبئة كافية. النوع الأكثر شيوعا من HPLC هو كروماتوغرافيا الطور العكسي ، والتي تستخدم مرحلة ثابتة كارهة للماء ، وعادة ما تكون حبات السيليكا مع سلاسل C18 مرتبطة بسطح الخرز. يتم تقويض المكونات بترتيب تقليل القطبية.
عادة ما تكون المرحلة المتنقلة المستخدمة في كروماتوغرافيا الطور العكسي عبارة عن خليط من الماء ومذيب عضوي ، مثل الأسيتونيتريل. اعتمادا على العينة ، يمكن أن تظل المرحلة المتنقلة نسبة ثابتة من الماء والمذيبات العضوية ، والمعروفة باسم الوضع المتساوي القراطي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا إلى قمم عريضة ، في حالة ارتفاع المحتوى المائي ، أو القمم المتداخلة - في حالة المحتوى العضوي العالي.
يمكن أيضا تغيير نسبة الطور المتنقل خطيا أو تدريجيا أثناء الفصل ، لإنشاء تدرج طور متحرك. يمكن أن يمنع الشطف المتدرج توسع الذروة للمكونات الأقل قطبية ، وبالتالي تحسين الفصل وتقصير وقت الشطف.
الآن بعد أن تم تحديد أساسيات HPLC ، سيتم عرض تقنية HPLC في المختبر. في هذه التجربة ، سيتم استخدام HPLC لفصل وتحديد ثلاثة مكونات شائعة من صودا الدايت.
أولا ، لتحضير المرحلة المتنقلة ، أضف 400 مل من الأسيتونيتريل إلى 1.5 لتر من الماء المنقى منزوع الأيونات. ثم أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي. خفف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2 لتر. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 و 3.2.
اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ هيدروكسيد الصوديوم ، حسب الانخفاض إلى محلول التحريك ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني المعاير.
قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشائي 0.47 متر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود. من المهم تفريغ المحلول ، حيث يمكن أن تسبب الفقاعات فراغات في المرحلة الثابتة ، أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف وتسبب عدم استقرار في القياسات.
قم بإعداد ثلاثة محاليل مكونة من الكافيين والبنزوات والأسبارتام ، وهي ثلاثة مكونات نموذجية للمشروبات الغازية الدايت. ثم يتم استخدام هذه الحلول المكونة لإعداد الحلول القياسية التي سيتم استخدامها لتحديد المجهول. تحضير 500 مل من محاليل الكافيين والبنزوات.
تحضير 100 مل من محلول مكون الأسبارتام. قم بتخزين المحلول في الثلاجة عندما لا يكون قيد الاستخدام لتجنب التحلل.
بعد ذلك ، قم بإعداد 7 محاليل قياسية ، لكل منها تركيزات مختلفة من الكافيين والبنزوات والأسبارتام. قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية ، وتخفيفها إلى علامة 50 مل مع الطور المتحرك.
يحتوي كل من الحلول الثلاثة الأولى على مكون واحد ، لتمكين تحديد الذروة. تحتوي المحاليل الأربعة الأخرى على مجموعة من تركيزات جميع المكونات الثلاثة ، من أجل ربط ارتفاع الذروة بالتركيز.
صب كل محلول قياسي في قارورة تحمل علامة في رف العينات. قم بتخزين رف العينة مع العينات والمحاليل المتبقية في الثلاجة.
أولا ، قم بإعداد المرحلة المتنقلة وحاويات النفايات. تأكد من تغذية خطوط النفايات في حاوية النفايات ، وعدم إعادة تدويرها مرة أخرى في المرحلة المتنقلة. تأكد من إدخال خط الطور المتحرك للمدخل في حاوية الطور المتحرك.
تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. سيمكن معدل التدفق هذا جميع المكونات من التصفية في غضون 5 دقائق ، ولكنه بطيء بما يكفي لضمان دقة القمم الفردية.
بعد ذلك ، تحقق من الحد الأدنى والأقصى للضغط على نظام توصيل المذيبات. تقوم هذه الإعدادات بإيقاف تشغيل المضخة في حالة حدوث تسرب أو انسداد ، على التوالي.
اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشفات ، لتعيين الفراغ. شطف 100-؟ حقنة L بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من 1 من 7 معايير عمل. ثم املأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون من أجل تحديد ذروة كل مكون.
بعد ذلك ، قم بحقن المحلول يدويا ، عن طريق وضع مقبض الحاقن في موضع التحميل. حقن ببطء 100 ? L من المحلول من خلال منفذ الحاجز.
تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يسمح بوقت كاف لجميع القمم الثلاثة لإخراج الكاشف. عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن ، من أجل حقن العينة في المرحلة المحمولة. على الفور ، انقر فوق "بدء الإصدار التجريبي" في برنامج جمع البيانات. عند اكتمال الفحص ، كرر العملية لكل من الحلول القياسية ال 7. لكل من المعايير الثلاثة الأولى ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة. لاحظ موقع الذروة ، والذي يستخدم لتحديد المكون.
حدد 3 عينات من صودا الدايت ، واسمح لها بالجلوس في حاويات مفتوحة طوال الليل لإزالة الكربنة.
بعد التفريغ طوال الليل ، اسحب ما يقرب من 3 مل من كل صودا دايت في حقنة بلاستيكية. بعد ذلك ، قم بتوصيل طرف مرشح بالمحقنة وادفع الصودا عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية ، لإزالة أي جزيئات صلبة.
خفف 2 مل من كل عينة مع 2 مل من المرحلة المتحركة لتقليل تركيز الصودا بمقدار النصف.
ارسم 100 ؟ L من إحدى عينات الصودا في حقنة ، وحقنها في حلقة العينة. قم بتشغيل الإصدار التجريبي بمعلمات متطابقة مع الحلول القياسية. كرر لكل عينة من الصودا.
أولا ، قم بربط مناطق الذروة للعينات القياسية بالتركيزات المعروفة. للقيام بذلك ، حدد مناطق الذروة على الكروماتوغراف لكل عينة قياسية باستخدام الطريقة المثلثة. احسب أوقات ارتفاع الذروة مع العرض عند نصف الارتفاع ، واستخدم هذه القيمة كمنطقة الذروة.
يؤدي استخدام منطقة الذروة والتركيزات المعروفة إلى إنشاء منحنى معايرة لكل مكون ، وتحديد المربعات الصغرى المناسبة لكل منحنى معايرة.
احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة. تذكر أن المشروبات الغازية تم تخفيفها جميعا بمعامل 2 قبل الحقن في HPLC. بناء على هذه النتائج ، احسب ملغ كل مكون في علبة 12 أونصة من الصودا.
مما لا يثير الدهشة ، أن جميع المشروبات الغازية الثلاثة التي تم اختبارها تحتوي على نفس الكمية تقريبا من البنزوات الحافظة. ومع ذلك ، احتوت منتجات الكولا على المزيد من الكافيين. ترتبط القيم المحسوبة لجميع المكونات ارتباطا جيدا بالقيم المبلغ عنها من قبل الشركات المصنعة.
HPLC هي أداة متعددة الاستخدامات للغاية ، وتستخدم في مجموعة واسعة من التحليلات.
غالبا ما يستخدم HPLC لتنقية جزيئات الببتيد. في هذا المثال ، تم تحضير مجمعات الببتيد عبر الغشاء ، ثم استقرت عن طريق التشابك التأكسدي للبروتينات مع روابط ثاني كبريتيد.
ثم تم إذابة البروتينات في حمض الفورميك ، وتنقيتها باستخدام HPLC المعكوس. ثم تم تصفية العينة باستخدام تدرج خطي لمذيبين ، وتم تأكيد النقاء باستخدام قياس الطيف الكتلي.
يمكن أيضا استخدام HPLC لتحديد المركبات العضوية المركبة في المختبر. في تجربة Miller-Urey ، تمت دراسة التخليق اللاأحيائي للمركبات العضوية على الأرض البدائية. تم إدخال الغازات البدائية ، مثل الميثان والأمونيا ، إلى قارورة تحتوي على الماء ، تحاكي المحيطات المبكرة. ثم تم تطبيق التفريغ الكهربائي ، لتقليد البرق على الأرض البدائية.
ثم تم تحليل المياه باستخدام HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي ، ومقارنتها بمعايير الأحماض الأمينية المعروفة. تم تصنيع 23 من الأحماض الأمينية وتحديدها في هذه التجربة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE إلى HPLC. يجب أن تفهم الآن أساسيات تشغيل الأداة وتحليل البيانات الناتجة.
شكرا للمشاهدة!
أثناء تجربة HPLC ، تأخذ مضخة الضغط العالي المرحلة المتحركة من الخزان عبر حاقن. ثم ينتقل عبر عمود معبأ ب C18 في المرحلة العكسية لفصل المكونات. أخيرا ، تنتقل المرحلة المتحركة إلى خلية كاشف ، حيث يتم قياس الامتصاص عند 220 نانومتر ، وتنتهي بزجاجة نفايات. يطلق على مقدار الوقت الذي يستغرقه أحد المكونات للانتقال من منفذ الحاقن إلى الكاشف وقت الاستبقاء.
يتم استخدام كروماتوجراف سائل في هذه التجربة ، حيث يتم إجراء الفصل على عمود الطور العكسي. أبعاد العمود هي 3 مم (ID) × 100 مم ، ويتم تشغيل عبوة السيليكا (حجم الجسيمات 3 ميكرومتر) باستخدام C18 octadecylsilane (ODS). يتم استخدام صمام الحقن الدوار Rheodyne ذو 6 منافذ لتخزين العينة في البداية في حلقة صغيرة وإدخال العينة إلى المرحلة المتنقلة عند دوران الصمام.
يتم الكشف عن طريق التحليل الطيفي للامتصاص بطول موجي يبلغ 220 نانومتر. يمكن تشغيل هذه التجربة عند 254 نانومتر ، إذا لم يكن الكاشف متغيرا. تحتوي البيانات من الكاشف على خرج جهد تناظري ، يتم قياسه باستخدام مقياس رقمي متعدد (DMM) ، ويقرأه جهاز كمبيوتر محمل ببرنامج الحصول على البيانات. يحتوي الكروماتوجرام الناتج على ذروة لكل مكون في العينة. بالنسبة لهذه التجربة ، يتم التخلص من المكونات الثلاثة في غضون 5 دقائق.
تستخدم هذه التجربة مرحلة متنقلة واحدة ومضخة ، والتي تسمى المرحلة المتحركة المتساوية. بالنسبة للعينات التي يصعب فصلها ، يمكن استخدام مرحلة متحركة متدرجة. يحدث هذا عندما تكون المرحلة المتنقلة الأولية في المقام الأول مرحلة مائية ، وبمرور الوقت ، تتم إضافة مرحلة متنقلة عضوية ثانية تدريجيا إلى المرحلة المتنقلة الشاملة. ترفع هذه الطريقة قطبية هذه المرحلة بمرور الوقت ، مما يقلل من أوقات الاحتفاظ بالمكونات ويعمل بشكل مشابه لتدرج درجة الحرارة على كروماتوجراف الغاز. هناك بعض الحالات التي يتم فيها تسخين العمود (عادة إلى 40 درجة مئوية) ، مما يزيل أي أخطاء في وقت الاستبقاء مرتبطة بتغير درجة الحرارة المحيطة.
في HPLC في المرحلة العكسية ، عادة ما تكون عبوة الطور الثابتة للعمود إما عبوة C4 أو C8 أو C18. أعمدة C4 مخصصة بشكل أساسي للبروتينات ذات الأوزان الجزيئية الكبيرة ، في حين أن أعمدة C18 مخصصة للببتيدات والعينات الأساسية ذات الأوزان الجزيئية المنخفضة.
الكشف عن طريق التحليل الطيفي للامتصاص هو طريقة الكشف المفضلة ، حيث أن أطياف امتصاص المكونات كلها متاحة بسهولة. تستخدم بعض الأنظمة القياسات الكهروكيميائية ، مثل الموصلية أو قياس الطموح ، كطريقة للكشف عنها.
< p class = "jove_content">بالنسبة لهذه التجربة ، تتكون المرحلة المتنقلة بشكل أساسي من 20٪ أسيتونيتريل و 80٪ من الماء المنقى منزوع الأيونات (DI). تضاف كمية صغيرة من حمض الأسيتيك لخفض درجة الحموضة في المرحلة المتنقلة ، مما يحافظ على السيلانول في مرحلة التعبئة الثابتة في حالة غير منفصلة. هذا يقلل من ذروة الامتزاز من المخلفات ، مما يعطي قمما أضيق. بعد ذلك ، يتم ضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 40٪ لرفع الرقم الهيدروجيني والمساعدة في تقليل أوقات الاحتفاظ بالمكونات. < p class = "jove_content" >تستخدم كل مجموعة مجموعة من 7 قوارير تحتوي على تركيزات مختلفة من المحاليل القياسية (الجدول 1). يتم استخدام أول 3 لتعريف كل ذروة ، وآخر 4 لإنشاء مخطط معايرة لكل مكون. تستخدم المعايير 1-3 أيضا لمخطط المعايرة. رقم الكافيين (مل) البنزوات (مل) الأسبارتام (مل) 1 4 0 0 2 0 4 0 3 0 0 4 4 1 1 1 5 2 2 2 6 3 3 3 7 5 5 5 < p class = "jove_content" > الجدول 1. أحجام معايير المخزون المستخدمة لإعداد معايير العمل السبعة المقدمة (الحجم الإجمالي لكل معيار هو 50 مل).الكروماتوجرامات HPLC قادرة على تحديد كل مكون من المكونات الثلاثة لجميع العينات بناء على منحنيات المعايرة للمعايير ( الشكل 3 ).
من هذه المجموعة من التجارب ، تقرر أن علبة سعة 12 أونصة من هذه المشروبات الغازية الدايت تحتوي على الكميات التالية من كل مكون:
دايت كوك: 50.5 ملغ الكافيين; 217.6 ملغ الأسبارتام. 83.6 ملغ بنزوات.
كوكاكولا زيرو: 43.1 ملغ كافيين. 124.9 ملغ الأسبارتام. 85.3 ملغ بنزوات.
دايت بيبسي: 34.1 ملغ كافيين. 184.7 ملغ الأسبارتام 79.5 ملغ بنزوات.
ليس من المستغرب أن تحتوي جميع الثلاثة على نفس الكمية تقريبا من البنزوات ، لأنها مجرد مادة حافظة. تحتوي منتجات الكولا على كمية أكبر قليلا من الكافيين ، وكان كوكاكولا زيرو يحتوي على كمية أقل بكثير من الأسبارتام من المشروبات الغازية الأخرى ، حيث يحتوي أيضا على حامض الستريك لبعض النكهات.
الأرقام التالية هي الكميات الفعلية من الكافيين والأسبارتام في علبة سعة 12 أونصة من 3 مشروبات غازية دايت (تم الحصول على محتوى الكافيين من مواقع Coca-Cola و Pepsi. تم الحصول على محتوى الأسبارتام من كل من LiveStrong.com و DiabetesSelfManagement.com.):
دايت كوك: 46 ملغ الكافيين; 187.5 ملغ الأسبارتام
كوكاكولا زيرو: 34 ملغ كافيين. 87.0 ملغ الأسبارتام
دايت بيبسي: 35 ملغ كافيين. 177.0 ملغ الأسبارتام
عينة من الحسابات (الجدول 2):
تركيز الكافيين في الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي # 1: يحتوي المحلول المكون للكافيين على 0.400 غرام من الكافيين المخفف إلى 500 مل = 0.500 لتر → 0.800 جم / لتر = 0.800 مجم / مل.
STD # 1 يحتوي على 1 مل من هذا المحلول المخفف إلى 50.0 مل
0.800 مجم / مل * (1.0 مل / 50.0 مل) = 0.016 مجم / مل = 16.0 مجم / لتر
STD # 2 يحتوي على 2 مل من هذا المحلول المخفف إلى 50.0 مل
0.800 مجم / مل * (2.0 مل / 50.0 مل) = 0.032 مجم / مل = 32.0 مجم / لتر
أسفرت النتائج من الرسوم البيانية الثلاثة للمعايرة ( الشكل 4 ) عن المعادلات التالية:
منطقة ذروة الكافيين = 0.1583 * [كافيين مجم / لتر] - 0.574
منطقة ذروة الأسبارتام = 0.02696 * [أسبارتام مجم / لتر] - 0.405
منطقة ذروة البنزوات = 0.1363 * [بنزوات مجم / لتر] - 1.192
دايت كولا: منطقة ذروة الكافيين = 10.68 = 0.1583 * [كافيين مجم / لتر] - 0.574
[الكافيين مجم / لتر] = (10.68 + 0.574) / (0.1583) = 71.1 مجم / لتر في العينة المحقونة.
نظرا لأن العينة تم تخفيفها بمعامل 2 ، كان دايت كولا يحتوي على 141.2 مجم / لتر من الكافيين.
الكمية لكل 12 أونصة = (141.2 مجم / لتر) (0.3549 مل / 12 أونصة) = 50.5 مجم كافيين / علبة.
الشكل 3. كروماتوجرامات HPLC للمعايير ال 5 و 3 عينات.
الشكل 4. منحنيات المعايرة لكل مكون من المكونات الثلاثة.
الجدول 2. جداول البيانات لتجارب HPLC المستخدمة لإنشاء منحنيات المعايرة.
HPLC هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع في الفصل والكشف للعديد من التطبيقات. إنه مثالي للمركبات غير المتطايرة ، حيث تتطلب كروماتوغرافيا الغاز (GC) أن تكون العينات في مرحلتها الغازية. تشمل المركبات غير المتطايرة السكريات والفيتامينات والأدوية والمستقلبات. كما أنه غير مدمر ، مما يسمح بجمع كل مكون لمزيد من التحليل (مثل قياس الطيف الكتلي). المراحل المتنقلة غير محدودة عمليا ، مما يسمح بإجراء تغييرات في قطبية الأس الهيدروجيني لتحقيق دقة أفضل. يسمح استخدام المراحل المتنقلة المتدرجة بهذه التغييرات أثناء التجارب الفعلية.
كان هناك قلق بشأن المشكلات الصحية المحتملة التي قد تكون مرتبطة بالتحلية الصناعية الأسبارتام. لا تظهر ملصقات المنتج الحالية كمية هذه المكونات داخل مشروبات الحمية. تسمح هذه الطريقة بتحديد هذه الكميات ، جنبا إلى جنب مع الكافيين والبنزوات.
تشمل التطبيقات الأخرى تحديد كميات المبيدات الحشرية في الماء. تحديد كمية الأسيتامينوفين أو الإيبوبروفين في أقراص مسكنات الألم ؛ تحديد ما إذا كانت هناك أدوية تعزيز الأداء الموجودة في مجرى الدم للرياضيين; أو ببساطة تحديد وجود المخدرات في مختبر الجريمة. في حين أن تركيزات هذه العينات ، وغالبا ما تكون هوية المكونات ، يمكن تحديدها بسهولة ، فإن القيد الوحيد هو أن العديد من العينات يمكن أن يكون لها أوقات احتفاظ قريبة من متطابقة ، مما يؤدي إلى المسح المشترك.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved