1. صنع مرحلة الهاتف المحمول
- قم بإعداد المرحلة المتنقلة عن طريق إضافة 400 مل من الأسيتونيتريل إلى ما يقرب من 1.5 لتر من ماء DI النقي.
- أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي إلى هذا المحلول. قم
- بتخفيف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2.0 لتر في قارورة حجمية بماء DI النقي. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 إلى 3.2.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ من هيدروكسيد الصوديوم ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي المعاير. أضف ببطء شديد بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني إلى 4.0. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 قطرة لإنجازها.
- قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء نايلون 66 0.47 ميكرومتر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود الكروماتوجرافي. من المهم تفريغ الطور المتحرك لتجنب وجود فقاعة ، والتي يمكن أن تسبب إما فراغا في المرحلة الثابتة عند مدخل العمود أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف ، مما يتسبب في عدم استقرار امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
2. إنشاء حلول المكونات
< p class = "jove_content">المكونات الثلاثة التي يجب تصنيعها هي الكافيين (0.8 مجم / مل) ، بنزوات البوتاسيوم (1.4 مجم / مل) ، والأسبارتام (L-aspartyl-L-فينيل ألانين ميثيل إستر) (6.0 مجم / مل). هذه التركيزات ، بمجرد تخفيفها بنفس الطريقة ، تضع المعايير عند المستويات الموجودة في عينات الصودا.- أضف 0.40 جم من الكافيين إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.70 جم من البنزوات إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.60 جم من الأسبارتام إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بماء DI. ضع هذا المحلول في الثلاجة لتجنب التحلل أثناء التخزين.
المكونات الثلاثة لها معاملات توزيع مختلفة ، مما يؤثر على كيفية تفاعل كل منها مع كلتا المرحلتين. كلما زاد معامل التوزيع ، زاد الوقت الذي يقضيه المكون في المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ أطول في الوصول إلى الكاشف.
- باتباع الرسم البياني في الجدول 1 ، قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية سعة 50 مل.
- قم بتخفيف كل من حلول المخزون إلى علامة 50 مل على القوارير الحجمية ذات الطور المتنقل.
- صب كل محلول قياسي في قوارير صغيرة مصنفة في رف عينة.
- قم بتخزين رفوف العينات في الثلاجة ، جنبا إلى جنب مع المحاليل المتبقية في قوارير حجمية سعة 50 مل.
4. التحقق من الإعدادات الأولية لنظام HPLC
- تأكد من أن خط النفايات موجود في حاوية نفايات ولا يتم إعادة تدويره مرة أخرى إلى المرحلة المتنقلة.
- تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. هذا مرتفع بما يكفي للسماح لجميع القمم بالتخلي في غضون 5 دقائق وبطيء بما يكفي للسماح بدقة جيدة.
- تحقق من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق على القيم الصحيحة على اللوحة الأمامية لنظام توصيل المذيبات (المضخة).
- الحد الأدنى لإعداد الضغط: 250 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لإغلاق المضخة ، في حالة حدوث تسرب).
- إعداد الضغط الأقصى: 4,000 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لحماية المضخة من الانكسار ، في حالة تشكل انسداد).
- اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشف لضبط الفراغ (الفراغ هو المرحلة المتنقلة النقية).
- اشطف حقنة سعة 100 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من أحد معايير العمل المراد تحليلها ، واملأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون ، مما يسمح بتحديد ذروة كل مكون محل اهتمام.
5. حقن العينة وجمع البيانات يدويا
- مع وجود مقبض الحاقن في وضع التحميل ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول ببطء من خلال منفذ الحاجز.
- تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يتيح وقتا كافيا لجميع القمم الثلاثة لتمريرها عبر الكاشف.
- عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن (الذي يحقن العينة في المرحلة المحمولة) وانقر فوق "بدء التجربة" في برنامج جمع بيانات الكمبيوتر على الفور. بالنسبة للمعايير 1-3 ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة المتسلسلة على الشاشة أثناء التشغيل (الشكل 1).
- بمجرد مرور 300 ثانية ، يرسل جمع البيانات مطالبة لحفظ ملف البيانات. احفظ البيانات تحت اسم ملف مناسب (على سبيل المثال ، STD # 1).
- لاحظ الوقت بالثواني لذروة كل تجربة ، والذي يستخدم في تحديد هذا المكون.
- قم بإزالة المحقنة من الحاجز وكرر العملية لكل من معايير العمل المتبقية ، باستخدام نفس الوقت لكل مخطط كروماتوغرام كما هو محدد من التشغيل الأول.
الشكل 1. الكروماتوجرام للمكونات الثلاثة. من اليسار إلى اليمين ، فهي الكافيين والأسبارتام والبنزوات. < p class = "jove_title" >6. عينات المشروبات الغازية الدايت
Diet Coke و Diet Pepsi و Coke Zero هي "المجهولة". لقد تركوا في حاويات مفتوحة طوال الليل للتخلص من الكربنة ، لأن الفقاعات ليست جيدة لنظام HPLC. هذا يتخلص بشكل كاف من أي غازات في العينات.
- ارسم حوالي 2 مل من صودا الدايت في حقنة بلاستيكية.
- قم بتوصيل طرف الفلتر بالمحقنة عبر Luer-Lok عن طريق لفها في مكانها.
- ادفع السائل الموجود في المحقنة عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية صغيرة. هذا يتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد عمود الفصل.
- خفف كل عينة بكمية متساوية من ماء DI ، بحيث تكون بدرجة نقاء 50٪.
- حقن 100 ميكرولتر من العينة في حلقة العينة ، وقم بإجراء تجارب بنفس المعلمات الخاصة بالمعايير.
7. الحسابات
- من تركيزات المحاليل المكونة ، احسب تركيز جميع المكونات في المعايير ، بناء على التخفيفات التي تم إجراؤها للعينات ال 7.
- حدد مناطق الذروة على الكروماتوغرام لكل معيار والعينات غير المعروفة بالطريقة المثلثة ، والتي تساوي ارتفاع الذروة مضروبا في العرض عند 1/2 ارتفاع (الشكل 2). بعد تحديد الذروة التي تتوافق مع كل مكون بناء على الوقت الذي يستغرقه كل مكون لإظهار الذروة الخاصة به ، أدخل مناطق الذروة هذه في جدول بيانات الكمبيوتر.
- قم بإنشاء منحنيات معايرة لمنطقة الذروة مقابل التركيز (ملغم / لتر) في معايير المكونات الثلاثة.
- حدد المربعات الأقل المناسبة لكل منحنى معايرة.
- احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة الموضحة في تجارب HPLC للعينات. تذكر أن صودا الدايت تم تخفيفها بمعامل 2 قبل حقنها في نظام HPLC.
- احسب الكمية ، بالملغم / لتر ، لكل مكون في المشروبات الغازية الدايت.
- بناء على النتائج ، احسب المليغرام من كل مكون موجود في علبة صودا سعة 12 أونصة. افترض أن 12 أونصة = 354.9 مل.
الشكل 2. مثال أساسي لذروة ارتفاع المنحنى وعرضه ، والتي يجب ضربها (ارتفاع الذروة مضروبة في العرض عند 1/2 ارتفاع).
المصدر: د. بول باور - جامعة بوردو
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي طريقة تحليلية مهمة شائعة الاستخدام لفصل مكونات العينات السائلة وتحديد…
1. صنع مرحلة الهاتف المحمول
- قم بإعداد المرحلة المتنقلة عن طريق إضافة 400 مل من الأسيتونيتريل إلى ما يقرب من 1.5 لتر من ماء DI النقي.
- أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي إلى هذا المحلول. قم
- بتخفيف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2.0 لتر في قارورة حجمية بماء DI النقي. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 إلى 3.2.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ من هيدروكسيد الصوديوم ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الرقمي المعاير. أضف ببطء شديد بمجرد أن يصل الرقم الهيدروجيني إلى 4.0. يجب أن يستغرق هذا حوالي 50 قطرة لإنجازها.
- قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء نايلون 66 0.47 ميكرومتر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود الكروماتوجرافي. من المهم تفريغ الطور المتحرك لتجنب وجود فقاعة ، والتي يمكن أن تسبب إما فراغا في المرحلة الثابتة عند مدخل العمود أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف ، مما يتسبب في عدم استقرار امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
2. إنشاء حلول المكونات
< p class = "jove_content">المكونات الثلاثة التي يجب تصنيعها هي الكافيين (0.8 مجم / مل) ، بنزوات البوتاسيوم (1.4 مجم / مل) ، والأسبارتام (L-aspartyl-L-فينيل ألانين ميثيل إستر) (6.0 مجم / مل). هذه التركيزات ، بمجرد تخفيفها بنفس الطريقة ، تضع المعايير عند المستويات الموجودة في عينات الصودا.- أضف 0.40 جم من الكافيين إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.70 جم من البنزوات إلى قارورة حجمية سعة 500 مل ، ثم خفف إلى علامة 500 مل بماء DI.
- أضف 0.60 جم من الأسبارتام إلى قارورة حجمية سعة 100 مل ، ثم خفف إلى علامة 100 مل بماء DI. ضع هذا المحلول في الثلاجة لتجنب التحلل أثناء التخزين.
المكونات الثلاثة لها معاملات توزيع مختلفة ، مما يؤثر على كيفية تفاعل كل منها مع كلتا المرحلتين. كلما زاد معامل التوزيع ، زاد الوقت الذي يقضيه المكون في المرحلة الثابتة ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ أطول في الوصول إلى الكاشف.
- باتباع الرسم البياني في الجدول 1 ، قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية سعة 50 مل.
- قم بتخفيف كل من حلول المخزون إلى علامة 50 مل على القوارير الحجمية ذات الطور المتنقل.
- صب كل محلول قياسي في قوارير صغيرة مصنفة في رف عينة.
- قم بتخزين رفوف العينات في الثلاجة ، جنبا إلى جنب مع المحاليل المتبقية في قوارير حجمية سعة 50 مل.
4. التحقق من الإعدادات الأولية لنظام HPLC
- تأكد من أن خط النفايات موجود في حاوية نفايات ولا يتم إعادة تدويره مرة أخرى إلى المرحلة المتنقلة.
- تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. هذا مرتفع بما يكفي للسماح لجميع القمم بالتخلي في غضون 5 دقائق وبطيء بما يكفي للسماح بدقة جيدة.
- تحقق من ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى للضغط ومعدل التدفق على القيم الصحيحة على اللوحة الأمامية لنظام توصيل المذيبات (المضخة).
- الحد الأدنى لإعداد الضغط: 250 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لإغلاق المضخة ، في حالة حدوث تسرب).
- إعداد الضغط الأقصى: 4,000 رطل لكل بوصة مربعة (هذا لحماية المضخة من الانكسار ، في حالة تشكل انسداد).
- اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشف لضبط الفراغ (الفراغ هو المرحلة المتنقلة النقية).
- اشطف حقنة سعة 100 ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من أحد معايير العمل المراد تحليلها ، واملأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون ، مما يسمح بتحديد ذروة كل مكون محل اهتمام.
5. حقن العينة وجمع البيانات يدويا
- مع وجود مقبض الحاقن في وضع التحميل ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول ببطء من خلال منفذ الحاجز.
- تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يتيح وقتا كافيا لجميع القمم الثلاثة لتمريرها عبر الكاشف.
- عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن (الذي يحقن العينة في المرحلة المحمولة) وانقر فوق "بدء التجربة" في برنامج جمع بيانات الكمبيوتر على الفور. بالنسبة للمعايير 1-3 ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة المتسلسلة على الشاشة أثناء التشغيل (الشكل 1).
- بمجرد مرور 300 ثانية ، يرسل جمع البيانات مطالبة لحفظ ملف البيانات. احفظ البيانات تحت اسم ملف مناسب (على سبيل المثال ، STD # 1).
- لاحظ الوقت بالثواني لذروة كل تجربة ، والذي يستخدم في تحديد هذا المكون.
- قم بإزالة المحقنة من الحاجز وكرر العملية لكل من معايير العمل المتبقية ، باستخدام نفس الوقت لكل مخطط كروماتوغرام كما هو محدد من التشغيل الأول.
الشكل 1. الكروماتوجرام للمكونات الثلاثة. من اليسار إلى اليمين ، فهي الكافيين والأسبارتام والبنزوات. < p class = "jove_title" >6. عينات المشروبات الغازية الدايت
Diet Coke و Diet Pepsi و Coke Zero هي "المجهولة". لقد تركوا في حاويات مفتوحة طوال الليل للتخلص من الكربنة ، لأن الفقاعات ليست جيدة لنظام HPLC. هذا يتخلص بشكل كاف من أي غازات في العينات.
- ارسم حوالي 2 مل من صودا الدايت في حقنة بلاستيكية.
- قم بتوصيل طرف الفلتر بالمحقنة عبر Luer-Lok عن طريق لفها في مكانها.
- ادفع السائل الموجود في المحقنة عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية صغيرة. هذا يتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد عمود الفصل.
- خفف كل عينة بكمية متساوية من ماء DI ، بحيث تكون بدرجة نقاء 50٪.
- حقن 100 ميكرولتر من العينة في حلقة العينة ، وقم بإجراء تجارب بنفس المعلمات الخاصة بالمعايير.
7. الحسابات
- من تركيزات المحاليل المكونة ، احسب تركيز جميع المكونات في المعايير ، بناء على التخفيفات التي تم إجراؤها للعينات ال 7.
- حدد مناطق الذروة على الكروماتوغرام لكل معيار والعينات غير المعروفة بالطريقة المثلثة ، والتي تساوي ارتفاع الذروة مضروبا في العرض عند 1/2 ارتفاع (الشكل 2). بعد تحديد الذروة التي تتوافق مع كل مكون بناء على الوقت الذي يستغرقه كل مكون لإظهار الذروة الخاصة به ، أدخل مناطق الذروة هذه في جدول بيانات الكمبيوتر.
- قم بإنشاء منحنيات معايرة لمنطقة الذروة مقابل التركيز (ملغم / لتر) في معايير المكونات الثلاثة.
- حدد المربعات الأقل المناسبة لكل منحنى معايرة.
- احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة الموضحة في تجارب HPLC للعينات. تذكر أن صودا الدايت تم تخفيفها بمعامل 2 قبل حقنها في نظام HPLC.
- احسب الكمية ، بالملغم / لتر ، لكل مكون في المشروبات الغازية الدايت.
- بناء على النتائج ، احسب المليغرام من كل مكون موجود في علبة صودا سعة 12 أونصة. افترض أن 12 أونصة = 354.9 مل.
الشكل 2. مثال أساسي لذروة ارتفاع المنحنى وعرضه ، والتي يجب ضربها (ارتفاع الذروة مضروبة في العرض عند 1/2 ارتفاع).
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، أو HPLC ، هي تقنية متعددة الاستخدامات تفصل مكونات الخليط السائل بناء على تفاعلاتها المختلفة مع الطور الثابت.
HPLC هو تكيف لكروماتوغرافيا العمود. في كروماتوغرافيا العمود ، يكون العمود مليئا بخرز دقيق النطاق يسمى المرحلة الثابتة. تعمل حبات الطور الثابتة مع مجموعات كيميائية تحفز التفاعل بين الخرزة ومكونات الخليط الموجود في الطور السائل أو المتحرك. عندما يتدفق الخليط عبر العمود ، تتفاعل المكونات مع المرحلة الثابتة بشكل مختلف.
في HPLC ، يتم إجراء كروماتوغرافيا العمود بمعدل تدفق أعلى ، وبالتالي ضغط أعلى ، من كروماتوغرافيا العمود الكلاسيكية. يتيح ذلك استخدام حبات الطور الثابتة الأصغر مع مساحة سطح أكبر إلى نسبة الحجم ، مما يزيد بشكل كبير من تفاعل الطور الثابت والمكونات في المرحلة المتنقلة.
سيقدم هذا الفيديو أساسيات تشغيل HPLC من خلال إظهار فصل مكونات المشروبات الغازية الدايت المختلفة.
هناك نوعان من HPLC المستخدمة في المختبر: تحليلي وتحضيري. في HPLC التحليلي ، يتم استخدام الأداة لتحديد مكونات الحجم الصغير ، ثم يتم التخلص من العينة التي تم تحليلها كنفايات. في HPLC التحضيري ، يتم استخدام الأداة لتنقية الخليط ويتم جمع الكمية المطلوبة من كل مكون في كسور.
تتكون أجهزة HPLC من سلسلة من المكونات البسيطة. أولا ، يتم ضخ المرحلة المتنقلة ، الموجودة في خزانات المذيبات ، عبر النظام بواسطة مضخة واحدة أو أكثر بمعدل تدفق ثابت. يتم حقن العينة في تيار الطور المتحرك بواسطة حاقن العينة. ثم يتم تسليم العينة ، المخففة بواسطة المرحلة المتنقلة ، إلى عمود HPLC ، حيث يتم فصل مكونات العينة. ثم يتم تحليل المكونات بواسطة الكاشف ، وإما حفظها في أجزاء لاستخدامها لاحقا ، أو نقلها إلى زجاجة نفايات.
عمود HPLC هو المكون الرئيسي للنظام. وهي تتألف من أسطوانة معدنية أو بلاستيكية ، معبأة بخرز دقيق الحجم من الطور الثابت ، أو راتنج الكروماتوغرافيا. يتدفق خليط العينة عبر طبقة الجسيمات المعبأة بمعدل تدفق ثابت ويتفاعل كل مكون مع المرحلة الثابتة أثناء تدفقه.
تتفاعل المركبات مع المرحلة الثابتة بشكل مختلف ، وبالتالي تنتقل على طول العمود إلى الكاشف بمعدل مختلف. يسمى الوقت المطلوب لأحد المكونات للخروج من العمود ، أو الملح ، وقت الاستبقاء. والنتيجة هي مخطط لوقت الاحتفاظ مقابل الشدة ، أو مخطط كروماتوغرام. يتم استخدام وقت الاستبقاء لتحديد المكون. يتم استخدام حجم الذروة ، وتحديدا المنطقة الواقعة تحت الذروة ، لتحديد كمية المركب في المحلول الأولي.
يعتمد اختيار المرحلة الثابتة على خصائص المكونات في خليط العينة. المرحلة الثابتة الأكثر استخداما هي حبات السيليكا ، لأنها مادة خاملة غير قطبية تشكل حبات صغيرة الحجم ، وتحقق كثافة تعبئة كافية. النوع الأكثر شيوعا من HPLC هو كروماتوغرافيا الطور العكسي ، والتي تستخدم مرحلة ثابتة كارهة للماء ، وعادة ما تكون حبات السيليكا مع سلاسل C18 مرتبطة بسطح الخرز. يتم تقويض المكونات بترتيب تقليل القطبية.
عادة ما تكون المرحلة المتنقلة المستخدمة في كروماتوغرافيا الطور العكسي عبارة عن خليط من الماء ومذيب عضوي ، مثل الأسيتونيتريل. اعتمادا على العينة ، يمكن أن تظل المرحلة المتنقلة نسبة ثابتة من الماء والمذيبات العضوية ، والمعروفة باسم الوضع المتساوي القراطي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا إلى قمم عريضة ، في حالة ارتفاع المحتوى المائي ، أو القمم المتداخلة - في حالة المحتوى العضوي العالي.
يمكن أيضا تغيير نسبة الطور المتنقل خطيا أو تدريجيا أثناء الفصل ، لإنشاء تدرج طور متحرك. يمكن أن يمنع الشطف المتدرج توسع الذروة للمكونات الأقل قطبية ، وبالتالي تحسين الفصل وتقصير وقت الشطف.
الآن بعد أن تم تحديد أساسيات HPLC ، سيتم عرض تقنية HPLC في المختبر. في هذه التجربة ، سيتم استخدام HPLC لفصل وتحديد ثلاثة مكونات شائعة من صودا الدايت.
أولا ، لتحضير المرحلة المتنقلة ، أضف 400 مل من الأسيتونيتريل إلى 1.5 لتر من الماء المنقى منزوع الأيونات. ثم أضف بعناية 2.4 مل من حمض الخليك الجليدي. خفف المحلول إلى حجم إجمالي قدره 2 لتر. يجب أن يكون للمحلول الناتج درجة حموضة بين 2.8 و 3.2.
اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.2 عن طريق إضافة 40٪ هيدروكسيد الصوديوم ، حسب الانخفاض إلى محلول التحريك ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني المعاير.
قم بتصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشائي 0.47 متر تحت الفراغ لتفريغ المحلول وإزالة المواد الصلبة التي يمكن أن تسد العمود. من المهم تفريغ المحلول ، حيث يمكن أن تسبب الفقاعات فراغات في المرحلة الثابتة ، أو تشق طريقها إلى خلية الكاشف وتسبب عدم استقرار في القياسات.
قم بإعداد ثلاثة محاليل مكونة من الكافيين والبنزوات والأسبارتام ، وهي ثلاثة مكونات نموذجية للمشروبات الغازية الدايت. ثم يتم استخدام هذه الحلول المكونة لإعداد الحلول القياسية التي سيتم استخدامها لتحديد المجهول. تحضير 500 مل من محاليل الكافيين والبنزوات.
تحضير 100 مل من محلول مكون الأسبارتام. قم بتخزين المحلول في الثلاجة عندما لا يكون قيد الاستخدام لتجنب التحلل.
بعد ذلك ، قم بإعداد 7 محاليل قياسية ، لكل منها تركيزات مختلفة من الكافيين والبنزوات والأسبارتام. قم بسحب الكمية المناسبة من كل مكون في قارورة حجمية ، وتخفيفها إلى علامة 50 مل مع الطور المتحرك.
يحتوي كل من الحلول الثلاثة الأولى على مكون واحد ، لتمكين تحديد الذروة. تحتوي المحاليل الأربعة الأخرى على مجموعة من تركيزات جميع المكونات الثلاثة ، من أجل ربط ارتفاع الذروة بالتركيز.
صب كل محلول قياسي في قارورة تحمل علامة في رف العينات. قم بتخزين رف العينة مع العينات والمحاليل المتبقية في الثلاجة.
أولا ، قم بإعداد المرحلة المتنقلة وحاويات النفايات. تأكد من تغذية خطوط النفايات في حاوية النفايات ، وعدم إعادة تدويرها مرة أخرى في المرحلة المتنقلة. تأكد من إدخال خط الطور المتحرك للمدخل في حاوية الطور المتحرك.
تحقق من ضبط معدل تدفق المرحلة المتنقلة على 0.5 مل/دقيقة. سيمكن معدل التدفق هذا جميع المكونات من التصفية في غضون 5 دقائق ، ولكنه بطيء بما يكفي لضمان دقة القمم الفردية.
بعد ذلك ، تحقق من الحد الأدنى والأقصى للضغط على نظام توصيل المذيبات. تقوم هذه الإعدادات بإيقاف تشغيل المضخة في حالة حدوث تسرب أو انسداد ، على التوالي.
اضغط على "صفر" على اللوحة الأمامية للكاشفات ، لتعيين الفراغ. شطف 100-؟ حقنة L بالماء منزوع الأيونات ، ثم بعدة أحجام من 1 من 7 معايير عمل. ثم املأ المحقنة بهذا المحلول. ابدأ ب 3 عينات أحادية المكون من أجل تحديد ذروة كل مكون.
بعد ذلك ، قم بحقن المحلول يدويا ، عن طريق وضع مقبض الحاقن في موضع التحميل. حقن ببطء 100 ? L من المحلول من خلال منفذ الحاجز.
تحقق من تعيين برنامج جمع البيانات لجمع البيانات لمدة 300 ثانية ، مما يسمح بوقت كاف لجميع القمم الثلاثة لإخراج الكاشف. عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، قم بتدوير مقبض الحاقن إلى موضع الحقن ، من أجل حقن العينة في المرحلة المحمولة. على الفور ، انقر فوق "بدء الإصدار التجريبي" في برنامج جمع البيانات. عند اكتمال الفحص ، كرر العملية لكل من الحلول القياسية ال 7. لكل من المعايير الثلاثة الأولى ، تظهر واحدة فقط من القمم الثلاثة. لاحظ موقع الذروة ، والذي يستخدم لتحديد المكون.
حدد 3 عينات من صودا الدايت ، واسمح لها بالجلوس في حاويات مفتوحة طوال الليل لإزالة الكربنة.
بعد التفريغ طوال الليل ، اسحب ما يقرب من 3 مل من كل صودا دايت في حقنة بلاستيكية. بعد ذلك ، قم بتوصيل طرف مرشح بالمحقنة وادفع الصودا عبر الفلتر إلى قارورة زجاجية ، لإزالة أي جزيئات صلبة.
خفف 2 مل من كل عينة مع 2 مل من المرحلة المتحركة لتقليل تركيز الصودا بمقدار النصف.
ارسم 100 ؟ L من إحدى عينات الصودا في حقنة ، وحقنها في حلقة العينة. قم بتشغيل الإصدار التجريبي بمعلمات متطابقة مع الحلول القياسية. كرر لكل عينة من الصودا.
أولا ، قم بربط مناطق الذروة للعينات القياسية بالتركيزات المعروفة. للقيام بذلك ، حدد مناطق الذروة على الكروماتوغراف لكل عينة قياسية باستخدام الطريقة المثلثة. احسب أوقات ارتفاع الذروة مع العرض عند نصف الارتفاع ، واستخدم هذه القيمة كمنطقة الذروة.
يؤدي استخدام منطقة الذروة والتركيزات المعروفة إلى إنشاء منحنى معايرة لكل مكون ، وتحديد المربعات الصغرى المناسبة لكل منحنى معايرة.
احسب تركيز كل مكون في المشروبات الغازية الدايت من مناطق الذروة. تذكر أن المشروبات الغازية تم تخفيفها جميعا بمعامل 2 قبل الحقن في HPLC. بناء على هذه النتائج ، احسب ملغ كل مكون في علبة 12 أونصة من الصودا.
مما لا يثير الدهشة ، أن جميع المشروبات الغازية الثلاثة التي تم اختبارها تحتوي على نفس الكمية تقريبا من البنزوات الحافظة. ومع ذلك ، احتوت منتجات الكولا على المزيد من الكافيين. ترتبط القيم المحسوبة لجميع المكونات ارتباطا جيدا بالقيم المبلغ عنها من قبل الشركات المصنعة.
HPLC هي أداة متعددة الاستخدامات للغاية ، وتستخدم في مجموعة واسعة من التحليلات.
غالبا ما يستخدم HPLC لتنقية جزيئات الببتيد. في هذا المثال ، تم تحضير مجمعات الببتيد عبر الغشاء ، ثم استقرت عن طريق التشابك التأكسدي للبروتينات مع روابط ثاني كبريتيد.
ثم تم إذابة البروتينات في حمض الفورميك ، وتنقيتها باستخدام HPLC المعكوس. ثم تم تصفية العينة باستخدام تدرج خطي لمذيبين ، وتم تأكيد النقاء باستخدام قياس الطيف الكتلي.
يمكن أيضا استخدام HPLC لتحديد المركبات العضوية المركبة في المختبر. في تجربة Miller-Urey ، تمت دراسة التخليق اللاأحيائي للمركبات العضوية على الأرض البدائية. تم إدخال الغازات البدائية ، مثل الميثان والأمونيا ، إلى قارورة تحتوي على الماء ، تحاكي المحيطات المبكرة. ثم تم تطبيق التفريغ الكهربائي ، لتقليد البرق على الأرض البدائية.
ثم تم تحليل المياه باستخدام HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي ، ومقارنتها بمعايير الأحماض الأمينية المعروفة. تم تصنيع 23 من الأحماض الأمينية وتحديدها في هذه التجربة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE إلى HPLC. يجب أن تفهم الآن أساسيات تشغيل الأداة وتحليل البيانات الناتجة.
شكرا للمشاهدة!
Q1: How does HPLC separate components in a liquid mixture?
HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.
Q2: What is the difference between analytical and preparative HPLC?
Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.
Q3: Why is degassing the mobile phase important in HPLC?
Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.
Q4: What does the chromatogram tell you about separated components?
A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.
Q5: What is reversed-phase chromatography and when is it used?
Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.
Q6: How does gradient elution improve HPLC separation?
Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.
Q7: Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?
HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved