استخدام مقياس كرات الدم (Hemacytometer) لعد الخلايا

يُعد عد الخلايا خطوة مهمة في العديد من المقايسات القائمة على الخلايا لتحديد عدد الخلايا وحيويتها. وبشكل عام، يهدف العد إلى معرفة مدى التخفيف المطلوب لعينة ذات تركيز خلوي غير معروف لاستخدامها لاحقاً. وتعتبر غرفة عد كريات الدم (hemacytometer) هي الأداة المختبرية الأكثر شيوعاً لعد الخلايا.

يعد مقياس كرات الدم (hemacytometer) أداة عد تم ابتكارها في الأصل لعد خلايا الدم. ويوجد في مركز مقياس كرات الدم حجرتان للعد، توجد عليهما شبكة محفورة بالليزر.

تتكون الشبكة من 9 مربعات رئيسية. وتنقسم المربعات الأربعة الموجودة في الزوايا إلى 16 مربعاً أصغر. أما المربع المركزي فينقسم إلى 25 من هذه المربعات الصغيرة، والتي ينقسم كل منها بدوره إلى 16 مربعاً دقيقاً.

توجد في الطرف البعيد من كل حجرة منافذ لإدخال العينات، حيث يتم وضع عينة الخلايا المراد عدها.

وعلى جانبي حجرات العد توجد دعامات تثبيت الشريحة الغطائية، والتي تستقر عليها الشريحة الغطائية المصنوعة من الكوارتز، وعادة ما تكون على ارتفاع 0.1 mm تقريباً فوق حجرة العد.

بما أن مساحة كل مربع كبير هي 1 mm2، فإن الحجم الذي يحتويه كل مربع كبير هو 0.1 mm3 أو 1/10,000 من الـ ml.

قبل البدء بالعد، خصص دائماً لحظة لاستخدام الإيثانول ومناديل kimwipe لتنظيف وتجفيف أي وبر أو بصمات أصابع أو آثار مائية من غطاء الشريحة وغرفة العد.

ثم أضف بعناية كمية صغيرة من الماء إلى كل من دعامات تثبيت غطاء الشريحة، حيث سيعمل التوتر السطحي للماء على تثبيت غطاء الشريحة في مكانه.

الآن قم بمجانسة معلق الخلايا برفق، أو سحبه ودفعه بواسطة الماصة، لتفكيك أي تكتلات خلوية. استخدم ماصة دقيقة لسحب حوالي 10 μl من المعلق، ثم قم بتعبئة إحدى فتحات الإدخال بالعينة. سيتم سحب المحلول إلى غرفة العد عن طريق الخاصية الشعرية ويجب أن يغطي الشبكة بأكملها.

بينما تترسب الخلايا، اختر العدسة الشيئية. ثم ضع مقياس كرات الدم (hemacytometer) على المنصة.

بعد ذلك، افحص الخلايا تحت المجهر. إذا كان هناك أقل من 5 خلايا في كل ربع من الأرباع الكبيرة، فقد تحتاج إلى إجراء طرد مركزي لعينتك مرة أخرى وإعادة تعليق الراسب في حجم أصغر. أما إذا كانت الخلايا متداخلة أو كثيفة جداً لدرجة يصعب معها تمييزها عن بعضها البعض، فقد تحتاج إلى تخفيف عينتك في حجم أكبر من المحلول. تأكد من تدوين معامل التخفيف الذي استخدمته للخلايا، حيث ستحتاج إليه في حساب لاحق.

الآن حان وقت عد الخلايا!

كما تحدثنا سابقاً، تكون غرفة العد مغطاة بشبكة محفورة بالليزر. تسهل خطوط المربعات تتبع الخلايا التي تقوم بعدّها. اختر حجم المربع المخصص للعد بناءً على كثافة الخلايا في عينتك. على سبيل المثال، إذا كان عدد الخلايا منخفضاً، قم بعدّ جميع الخلايا في أحد المربعات الركنية. أما بالنسبة للعينات ذات العدد المتوسط من الخلايا، فاختر واحداً من المربعات الـ 16 الأصغر. وإذا كانت كثافة الخلايا عالية جداً، فقم بعدّ الخلايا في واحد من المربعات الـ 25 المركزية. وبغض النظر عن المربع الذي تختاره أو كثافة عينة الخلايا، قم بعدّ ما لا يقل عن 20-50 خلية لكل مربع.

لن تقع جميع الخلايا بدقة داخل المربعات؛ لذا يمكنك عدّ الخلايا التي تلامس الخطين العلوي والأيسر، مع تجاهل الخلايا التي تلامس الخطين السفلي أو الأيمن. وللحصول على أدق عدد، استخدم عداد خلايا لتتبع الخلايا واحسب متوسط عدد الخلايا في 4 مربعات من نفس الحجم.

لحساب عدد الخلايا في حجم 1 ml، اضرب عدد الخلايا التي تم عدّها في 10,000، لأنه، كما ذكرنا سابقاً، كل مربع كبير في الشبكة يمثل 1/10,000 من الـ ml. إذا قمت بعدّ أحد هذه المربعات الكبيرة، فاضرب هذا العدد ببساطة في 1. وإذا قمت بعدّ أحد المربعات الأصغر في أحد المربعات الركنية، فاضرب هذا العدد في 16. أما إذا قمت بعدّ جميع الخلايا في واحد من المربعات الـ 25 المركزية، فاضرب هذا العدد في 25. وإذا كنت قد قمت بتخفيف معلق الخلايا قبل تحميله في مقياس كرات الدم (hemacytometer)، فستحتاج أيضاً إلى الضرب في عامل التخفيف.

بعد ذلك، لحساب عدد الخلايا في 1 ml من هذه العينة، سنقوم بضرب الـ 20 خلية الموجودة في هذا المربع المركزي في 104 و 25 لنحصل على إجمالي 5 x 106 خلية في 1 ml من العينة.

الآن وبعد أن عرفنا العدد الإجمالي للخلايا في 1 ml من العينة، نحتاج إلى ضرب هذا العدد في الحجم الإجمالي لمحلولنا. على سبيل المثال، إذا كان لدينا 5 x 106 خلية في 1 ml، فسيكون لدينا في 2 ml إجمالي 1 x 107 خلية.

ثم، ولتجنب الأخطاء الناتجة عن الخطأ في العد، أو التوزيع غير المتساوي للخلايا، أو أخطاء الماصة، قم بتحميل الجانب الآخر من الغرفة وعدّ عينة الخلايا مرة ثانية.

يُعد عد الخلايا تحت المجهر فرصة ممتازة أيضاً لتقييم حيوية الخلايا في عينتك. وغالباً ما يتم خلط صبغة Trypan blue، وهي صبغة حيوية، مع العينة قبل تحميلها في مقياس كريات الدم (hemacytometer) لهذا الغرض.

تستبعد الخلايا الحية هذه الصبغة، لأن الخلايا الحية تكون انتقائية للغاية بشأن المواد التي تسمح بمرورها عبر أغشيتها. أما الخلية الميتة، فلا تملك غشاءً سليماً، مما يسمح لصبغة Trypan blue بالمرور وصبغ السيتوبلازم.

للتحقق من حيوية عينة الخلايا، قم بتخفيف جزء من معلق الخلايا في صبغة Trypan blue، ثم قم بتحميل العينة المصبوغة بـ Trypan blue تماماً مثل عينة الخلايا العادية. تحت مجهر تباين الطور (phase contrast)، ستظهر الخلايا الحية ساطعة وذهبية ويجب عدها؛ ولا تقم بعدد أي من الخلايا الميتة الزرقاء الباهتة.

احسب عدد الخلايا كما سبق، مع ضرب العدد النهائي هذه المرة في عامل تخفيف Trypan blue. فإذا كانت عينتنا التمثيلية الأصلية قد خُففت أولاً في Trypan blue، فإننا سنقوم حينئذٍ بضرب إجمالي عدد الخلايا في تخفيف Trypan blue بنسبة 1:10، ليصبح المجموع 1x108 خلايا في عينتنا.

عند الانتهاء من العد، تذكر تنظيف غطاء الشريحة وغرفة العد!

بما أنك أصبحت محترفاً في عد الخلايا، فلنتحدث عن بعض الأسباب التي قد تجعلك بحاجة لمعرفة عدد الخلايا لديك في تجربة معينة.

بعد عزل الخلايا من نسيج طبيعي أو تجريبي، من المهم معرفة عدد الخلايا التي تم استعادتها. هنا سيرغب الباحثون في معرفة عدد الخلايا الطحالية، أو خلايا الطحال، التي قاموا بعزلها من طحال هذا الفأر.

عند إجراء تجربة لمعرفة كيفية تفاعل مجتمعين خلويين مختلفين، من المهم معرفة عدد كل نوع من الخلايا التي يتم خلطها معاً، كما هو الحال في تجربة الزراعة المشتركة هذه باستخدام خلايا B وT.

ستحتاج إلى معرفة عدد الخلايا لديك للعديد من أنواع المقايسات القائمة على الخلايا. هنا يتم إعداد مقايسة ELISPOT لتحديد عدد الخلايا في العينة التي ستفرز IFNγ، وهو بروتين التهابي، استجابةً لفيروس الورم الحليمي البشري.

عند إجراء تجربة تتطلب استخلاص أو عزل mRNA من الخلايا المستهدفة، من المهم معرفة عدد الخلايا التي تبدأ بها، وذلك للحصول على كمية كافية من mRNA للتجربة.

يعد مقياس كرات الدم (hemacytometer) أداة غير مكلفة وسهلة الاستخدام نسبياً لعد الخلايا، ولكنها قد تكون مرهقة وعرضة للخطأ البشري.

جهاز Scepter Handheld Automatic Counter هو، كما يشير اسمه، جهاز عد محمول باليد يتميز بدقة عد محسنة مقارنة بمقياس كرات الدم، ويمكنه التمييز بين كل من حجم وحجم الخلايا في عينة خلوية.

يقوم عداد الخلايا الآلي TC10 بتقييم كل من عدد الخلايا وحيويتها، ويحسب تلقائياً العدد الإجمالي للخلايا في عينتك، كما يتيح رؤية الخلايا على شاشة القراءة الخاصة به أيضاً.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول عد الخلايا. استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية مقياس كرات الدم (hemacytometer)، وكيفية عد الخلايا وتحديد حيويتها، وبعض الأسباب المختلفة التي قد تدفعكم للحاجة إلى عد الخلايا. شكراً للمشاهدة، وتذكروا ألا تقوموا بعدّ الخلايا الزرقاء!