تنقية البلازميد

البلازميدات هي جزيئات DNA دائرية وخارج كروموسومية، وتعمل في البيولوجيا الجزيئية كناقلات لقطعة محددة من DNA. وتُستخدم البكتيريا لتكرار البلازميدات، مما يسمح بإنتاج كميات كبيرة من DNA المستهدف. تُسمى العملية التي يحصل من خلالها الباحثون على البلازميدات من البكتيريا بتنقية البلازميد، وهو ما سيتم شرحه في هذا الفيديو.

من الواضح أن تنقية البلازميدات تتضمن عملية تنقية البلازميدات، ولكن ماذا يعني ذلك تحديداً؟ لتنقية البلازميدات، يجب عزلها عن الكروموسوم البكتيري، والبروتينات، والغشاء البكتيري، والريبوسومات البكتيرية.

على الرغم من وجود العديد من الأطقم المختلفة لتنقية البلازميدات، إلا أن المبدأ الأساسي وراء عملية تنقية البلازميدات يظل كما هو في جميعها. أولاً، يتم إنماء المستعمرة البكتيرية المختارة في وسط زراعي مناسب يحتوي على المضادات الحيوية الصحيحة. وبفضل جين مقاومة المضاد الحيوي، الذي يشفر بواسطة البلازميد، ستنمو فقط البكتيريا التي تحتوي على البلازميد في هذا الوسط. ثم يتم حصاد البكتيريا وتحليلها في ظل pH مرتفع. بعد ذلك، يتم معادلة الـ pH، وإضافة الملح، ثم يتم تدوير الخليط باستخدام جهاز الطرد المركزي لإزالة الحطام والحمض النووي الجينومي.

يُضاف محلول تحليل الخلايا المُعادل إلى عمود سيليكا. ويُعتقد أن الحمض النووي للبلازميد يلتصق بالعمود عبر آلية تسمى التبادل الأنيوني، حيث يرتبط الحمض النووي، وهو أنيون قوي، بالعمود المشحون سلبياً عبر جسر ملحي كاتيوني. أما المواد الأخرى الموجودة في محلول التحليل، مثل البروتينات، فيتم غسلها من خلال العمود باستخدام محاليل منظمة عالية الملوحة. وأخيراً، يتم تحرير البلازميد المنقى من العمود عند إضافة محلول منظم منخفض الملوحة يعمل على تكسير الجسر الملحي.

يجب ارتداء معطف المختبر، وقفازات تستخدم لمرة واحدة، ونظارات واقية لهذا الإجراء.

يجب تنمية المزارع البكتيرية، التي تم تحويلها باستخدام DNA البلازميد المطلوب، طوال الليل في أوساط نمو تحتوي على المضاد الحيوي المناسب في حاضنة هزازة عند 37°C.

في اليوم التالي، يتم تجميع المزرعة البكتيرية في شكل كريات عن طريق الطرد المركزي ثم يتم إزالة السائل الطافي. وتُعاد تعليق الكريات المتبقية في محلول التحلل (lysis buffer).

بمجرد إعادة التعليق، يمكن نقل البكتيريا إلى أنبوب أصغر حيث يتم إضافة محلول التحلل. يتميز محلول التحلل بـ pH مرتفع ويحتوي على منظفات، مثل sodium dodecyl sulfate، التي تعمل على تفكيك الأغشية البكتيرية، وبالتالي تحلل البكتيريا. سيتحول المحلول إلى اللون العكر عند إضافة محلول التحلل، وبعد الخلط يصبح المحلول أكثر صفاءً. يجب عدم استخدام جهاز الرج (vortex) للمزيج بسبب احتمالية قص أو تكسير DNA الجينومي، مما قد يؤدي إلى تلوث عملية تنقية DNA البلازميد.

بعد ذلك، يتم إضافة محلول التعادل (neutralization buffer) لمعادلة الظروف القلوية وخفض pH. ومع الخلط اللطيف، سيترسب DNA الجينومي بالإضافة إلى أي بروتينات مرتبطة به، بينما يبقى DNA البلازميد في المحلول. تجنب استخدام جهاز الرج مرة أخرى، وذلك لضمان خلو البلازميدات من تلوث DNA الجينومي.

يتم بعد ذلك طرد المزيج مركزياً لتجميع راسب DNA الجينومي والبروتينات في شكل كريات. ويحتوي السائل الطافي على DNA البلازميد بالإضافة إلى البروتينات الذائبة.

يُنقل هذا السائل الطافي إلى العمود عن طريق الصب أو باستخدام الماصة. ويمكن التخلص من الكريات.

بعد ذلك، يمر محلول غسيل عالي الملوحة عبر العمود بينما يظل DNA مرتبطاً بالسيليكا. وتعمل خطوات الغسل المتكررة بمحلول عالي الملوحة على إزالة الإنزيمات القاطعة الداخلية (endonucleases)، وRNA، والبروتينات، والأصباغ، والشوائب ذات الوزن الجزيئي المنخفض. يجب التخلص من السائل المار عبر خطوات الغسيل. بعد خطوة الغسيل النهائية، تأكد من أن المرشح جاف تماماً دون بقاء أي محلول. لا يزال DNA البلازميد مستقراً على المرشح.

يتم استخلاص DNA البلازميد باستخدام ماء معقم أو محلول استخلاص (elution buffer). ويكون DNA متاحاً للاستخدام الفوري في مجموعة واسعة من التطبيقات.

هناك عدة طرق للتحقق من نقاوة البلازميدات بعد التنقية. يمكن استخدام جهاز المطياف (spectrometer) لمقارنة الامتصاصية عند أطوال موجية مختلفة لتحديد تركيز DNA البلازميد. كما يمكن لتحليل هلام الأجاروز (agarose gel) للبلازميد المنقى تحديد ما إذا كان البلازميد بالحجم الصحيح وعدم وجود ملوثات. تضمن هذه الخطوة عدم وجود تلوث بـ DNA الجينومي وعدم تعديل البلازميد داخل البكتيريا.

يمكن تعديل إجراء تنقية البلازميد ليتناسب مع أحجام البلازميد المختلفة، وعدد النسخ، وحجم المزرعة، ويمكن أن يتضمن معدات مختلفة لخطوات الربط، والغسيل، والاستخلاص. وتعتبر الحصيلة واحدة من أبرز الفوارق بين تحضيرات البلازميد، وغالباً ما تُقسم إلى التحضير المصغر (miniprep)، والتحضير المتوسط (midiprep)، والتحضير الأقصى (maxiprep)، والتحضير العملاق (megaprep) بناءً على الحصيلة المطلوبة.

أما بالنسبة للتطبيقات اللاحقة، فإن أحد الإجراءات التي تلي تنقية البلازميد عادةً هو عفن الخلايا أو "الترانسفكشن" (transfection)، والذي يتضمن إدخال الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) إلى الخلايا حقيقية النواة. وغالباً ما يكون الهدف من تجربة عفن الخلايا هو تصوير بنية الخلايا والأنسجة باستخدام بروتينات مُبلّغة، مثل تلك التي تميز الخلايا العصبية في الصور التي تراها هنا.

في بعض الأحيان، يمكن إدخال بلازميدات متعددة تمت تنقيتها عبر عدة تحضيرات تنقية في البكتيريا نفسها، وبذلك يتم إعادة إنتاج مسار تخليق حيوي كامل من خلال إنتاج عدد من الإنزيمات التي تشفرها البلازميدات. والنتيجة النهائية هي تصنيع الخلية لمركب معقد، مثل المضاد الحيوي الذي تراه هنا.

ويمكن إعادة إدخال البلازميدات المنقاة إلى البكتيريا من أجل توليد كميات كبيرة من البروتين الذي يشفره البلازميد. ترى هنا الخلايا البكتيرية وهي تتعرض للتجانس والتحلل قبل إجراء تقنية تسمى التنقية بالألفة (affinity purification) لعزل البروتين المستهدف. ثم يتم بلورة البروتين المنقى وتحديد بنيته.

لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تنقية البلازميد. ناقشنا في هذا الفيديو المبادئ الأساسية الكامنة وراء هذه الطريقة، ووصفاً تفصيلياً لخطواتها، ومجموعة من تطبيقات تحضير البلازميد الخاص بكم. وكما هو الحال دائماً، نشكركم على المشاهدة!