هضم الإنزيمات القاصرة

تُستخدم إنزيمات التقييد، أو إنزيمات القطع الداخلية، في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة في البيولوجيا الجزيئية. تتعرف هذه الإنزيمات على تسلسل محدد من DNA وتقوم بقطعه، ويسمى هذا التسلسل موقع التقييد. يقدم الفيديو الذي ستشاهده الآن بعض المعلومات الأساسية حول هذه الجزيئات المذهلة، ويوضح كيفية إعداد عملية هضم إنزيم التقييد.

من أين تأتي إنزيمات القطع في الأصل؟ تُعد هذه الإنزيمات تكيفاً للبكتيريا حيث تعمل كآلية دفاع ضد الفيروسات المعروفة باسم العاثيات (bacteriophages). وبفضل إضافة مجموعات الميثيل إلى مواقع إنزيمات القطع في الحمض النووي البكتيري، لا تتعرف إنزيمات القطع إلا على الحمض النووي للعاثيات وتقوم بقصه، مما يمنع حدوث العدوى.

تمتلك إنزيمات القطع أسماءً غريبة نوعاً ما؛ على سبيل المثال HindIII و NotI و EcoRI و BamHI. تشير الأحرف الثلاثة الأولى من اسم إنزيم القطع إلى الكائن الذي عُزل منه. فعلى سبيل المثال، عُزل إنزيم القطع EcoRI من بكتيريا E. coli. ويشير الحرف الرابع، عند الضرورة، إلى السلالة البكتيرية التي عُزل منها الإنزيم. أما الرقم الروماني فيوضح ما إذا كان هذا هو الإنزيم الأول أو الثاني أو الثالث الذي تم عزله من ذلك الكائن المحدد.

تتعرف إنزيمات التقييد على تسلسل من النيوكليوتيدات، يتراوح طوله عادةً بين أربعة وثمانية أزواج قاعدية، ويُسمى موقع التعرف. وعند نيوكليوتيدات محددة ضمن هذا التسلسل، يقوم الإنزيم بكسر الروابط الفوسفاتية ثنائية الأستر في هيكل الحمض النووي DNA. وعادةً ما تكون مواقع التعرف متناظرة (palindromic)، مما يعني أن التسلسل يُقرأ بنفس الطريقة من الأمام ومن الخلف. وعندما يوجد هذا التناظر على خيوط متكاملة من جزيء DNA، يُسمى تناظراً بتكرار معكوس.

يمكن أن تترك إنزيمات التقييد أنواعاً مختلفة من النهايات بمجرد قطع DNA: النهايات اللاصقة والنهايات البليدة. تترك النهايات اللاصقة بروزات 3’ و 5’، بينما لا تترك النهايات البليدة أي بروزات. ويحدد نوع النهاية كيفية إعادة دمج قطعة DNA التي تم عزلها بواسطة هضم إنزيم التقييد مع قطع DNA أخرى في عملية تُعرف بالربط (ligation).

يجب التخطيط بعناية لعملية الهضم باستخدام إنزيمات التقييد. يتكون تفاعل الهضم عادةً مما يلي: ماء منزوع الأيونات، والحمض النووي DNA المراد قطعه، ومحلول منظم (buffer) خاص بالإنزيم المستخدم، وأحياناً بروتين يسمى ألبومين المصل البقري أو BSA. يعمل BSA على تثبيت التفاعل عن طريق منع الإنزيم من الالتصاق بجدار الوعاء الذي يتم فيه الهضم. قد يتطلب كل إنزيم تقييد ظروفاً مختلفة من المحلول المنظم، ودرجات حرارة تحضين، واشتراطات مختلفة لاستخدام BSA. ويوفر موردو إنزيمات التقييد موارد يمكن الرجوع إليها للحصول على جميع المعلومات اللازمة.

لبدء إعداد عملية الهضم، استخرج إنزيم التقييد من المجمد أو الثلاجة. احتفظ بإنزيم التقييد على الثلج أو في وعاء مقاوم للحرارة لضمان النشاط الأمثل للتفاعلات المستقبلية. يجب إضافة مكونات التفاعل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (microfuge tube) بالترتيب التالي: أولاً، حجم من الماء المعقم والخالي من النوكلياز ليكون حجم التفاعل النهائي 20μL. ثم محلول منظم لإنزيم التقييد بتركيز 10x، ثم BSA إذا لزم الأمر، وما يصل إلى 1μg من DNA، ومن 2 إلى 10 وحدات من الإنزيم. وتُعرّف الوحدات بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإجراء هضم كامل لـ 1μg من DNA ضابط في غضون 60 دقيقة عند 37°C في حجم تفاعل قدره 50μL. بعد ذلك، اخلط المكونات باستخدام جهاز الرج (vortexing)، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة عند 12,000xg في جهاز طرد مركزي دقيق لتجميع المحتويات في قاع الأنبوب. ثم حضّن الخليط عند درجة الحرارة المثلى لإنزيم التقييد الخاص بك، وعادةً ما تكون 37°C في قالب تسخين لمدة تتراوح من ساعة إلى 4 ساعات.

بمجرد اكتمال عملية الهضم، يفضل تحضين خليط التفاعل عند 65˚C لتعطيل إنزيمات التقييد حرارياً. وبينما تقوم إنزيمات التقييد بالقطع في مواقع محددة في معظم الأحيان، فإن فترات التحضين الطويلة قد تؤدي إلى "نشاط النجمة" (star activity)، وهو القطع في مواقع مشابهة ولكنها مختلفة عن مواقع الهضم المعتادة.

بعد التعطيل، يجب إجراء تحليل لـ DNA على هلام الأجاروز (agarose gel) للتأكد من نجاح عملية الهضم.

إليك بعض الملاحظات المفيدة لإجراء عمليات الهضم الإنزيمي وضمان نجاحها.

قد تجد نفسك أحياناً في حالة تتطلب استخدام إنزيمات متعددة لإنتاج قطعة DNA محددة. في هذه الحالة، يجب عليك التحقق من توافق ظروف المنظم (buffer) ودرجات حرارة الحضانة بين الإنزيمين؛ فإذا كانت متوافقة، يمكنك إجراء هضم مزدوج وجعل كلا الإنزيمين يقطعان في التفاعل نفسه. ومع ذلك، قد تجد أحياناً عدم توافق في ظروف التفاعل بين الإنزيمين، وفي هذه الحالة يكون الحل البديل هو استخدام الإنزيمات بالتتابع. فعلى سبيل المثال، يمكن إجراء الهضم باستخدام إنزيم واحد أولاً، ثم تعديل تركيب المنظم ليكون مثالياً للإنزيم الثاني. وهناك طريقة أخرى للتغلب على عدم توافق المنظم وإجراء هضم تتابعي وهي تنقية DNA بعد الهضم الأولي ثم إجراء الهضم الثاني.

يعد استخدام الضوابط (controls) وسيلة جيدة لفهم سبب فشل عملية الهضم. فعلى سبيل المثال، يتيح لك ضابط "بدون إنزيم" التحقق من سلامة عينة DNA وتحديد ما إذا كان هناك نشاط لإنزيم الإكسونوكلياز (exonuclease). كما يسمح استخدام DNA ضابط بمواقع تقييد معروفة باختبار نشاط الإنزيم.

بعد أن رأينا كيف يتم إجراء عمليات الهضم، دعونا نلقي نظرة على الطرق المختلفة التي يمكن من خلالها استخدام إنزيمات القطع.

يمكن استخدام إنزيمات القطع تشخيصياً من أجل تحديد عينات معينة. فمن خلال تحميل ناتج الهضم في شريحة متخصصة ثم وضع هذه الشريحة في جهاز يسمى المحلل الحيوي (bioanalyzer)، يستطيع الباحثون فحص أحجام قطع DNA الناتجة عن الهضم لتحديد مدى أصالة عينات الأسماك. وتسمى أنماط النطاقات المختلفة لنفس الجين من نوع معين، أو في هذه الحالة من أنواع مختلفة، بتعدد أشكال طول قطع التقييد (restriction fragment length polymorphisms).

يمكن أيضاً استخدام إنزيمات القطع في الاستنساخ الفرعي (subcloning) لعزل قطعة من DNA من بلازميد واحد وإدخالها في بلازميد آخر، بحيث يمكن تكرار القطعة المطلوبة باستخدام البكتيريا.

من خلال توظيف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإدخال مواقع قطع في الجينات في مواقع محددة للغاية، يمكن استخدام إنزيمات القطع لتحديد وجود اختلافات في النيوكليوتيدات المفردة في أشكال بديلة من نفس الجين، أو الأليل. إن تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة هذه، أو SNPs، يصعب اكتشافها باستخدام PCR والترحيل الكهربائي للهلام وحدهما. ومع إدخال موقع القطع ضمن الـ SNP، يمكن لعملية هضم بسيطة أن تميز بين الأليلات.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إنزيمات القطع. لقد تعرفت على مصدر هذه الإنزيمات، وتعلمت بعض الأساسيات حول آلية عملها، ورأيت كيفية إعداد عملية الهضم الإنزيمي، وعرفت كيف يمكن استخدام إنزيمات القطع في البيولوجيا الجزيئية. وكما هو الحال دائماً، شكراً للمشاهدة!