الزرد حقن الدماغ البطين

يبدأ هذا الإجراء بتحديد مراحل أجنة الزرد. عندما تصل الأجنة إلى مرحلة الاهتمام ، قم بإزالتها من القنبلة. بعد ذلك ، يتم إنشاء ثقوب في طبق مغطى برأس ماصة لتركيب الأجنة وتوضع الأجنة برفق في الثقوب مع ذيولها لأسفل.

بعد تركيب الأجنة ، يتم حقن قالب الفلورسنت بعناية في مساحة البطين للجنين من خلال الدماغ الخلفي. بعد حقن البطين ، يتم تصوير الأجنة ومعالجة البيانات باستخدام Photoshop. مرحبا ، أنا جينيفر جوتمان من مختبر الدكتورة هازل سيف في معهد وايتهيد للأبحاث الطبية الحيوية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا في كامبريدج ، ماساتشوستس.

سنعرض لك اليوم إجراء لحقن بطين الدماغ لسمك الزرد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تكوين البطين في الدماغ وتكوين الظهارة العصبية في أسماك الزرد الحية. نظرا لطبيعة أجنة الزرد الشفافة ، قد يكون من الصعب توصيف شكل بطين الدماغ.

هذه التقنية هي طريقة مفيدة وبسيطة للتمييز بين المساحة المملوءة بالسوائل والأنسجة المحيطة وتوصيف الأجنة الطافرة التي قد تحتوي على عيوب في تكوين البطين في الدماغ. لذلك دعونا نبدأ. للتحضير لحقن بطين دماغ الزرد ، نبدأ بعمل إبر الحقن.

يتم استخدام إبرة آلة Sutter القطبية لسحب الإبر الشعرية. ثم تمتلئ الإبرة الشعرية بصبغة فلورية ، مثل دكسترين تكساس الأحمر. بعد ذلك ، يتم تثبيت الإبرة المملوءة في مناور دقيق في جهاز الحقن المجهري.

قطع الإبرة إلى الحجم المناسب بزاوية. لإنشاء طرف مشطوف ، قم بقياس حجم قطرة الإبرة وتأكد من أنه يتراوح بين نانولتر إلى نانولتر لكل حقنة في الزيت. لبدء مرحلة الإجراء هذه ، يجب حقن الأجنة ، وفقا ل Kimmel في جميع الأجنة قبل 30 دقيقة من مرحلة الاهتمام.

على سبيل المثال ، لدراسة البطينين بعد 24 ساعة من الإخصاب ، حقن الأجنة بعد 23 ساعة ونصف من الإخصاب. يتم وضع الجنين في مرحلة الاهتمام تحت المجهر الاستريو ، ويتم إزالة القرنب بعناية من الجنين باستخدام الملقط. بعد ذلك ، يتم صنع طبق أروس للأجنة باستخدام طبق بلاستيكي مغطى بثقوب 1٪ من الثقوب في الأروس مع طرف ماصة بلاستيكي إلى 200 ميكرولتر.

قم بإزالة سدادات aros بعناية من الثقوب باستخدام ملقط. انقل وسائط الجنين والجنين إلى طبق الأقروس به ثقوب. أضف trica إلى الوسائط لتخدير الجنين ومنع الحركة.

أثناء التجربة ، ضع ذيل الجنين برفق في الحفرة ووجهه بحيث يكون جهاز الحقن على الجانب الخلفي من الجنين. الآن بعد أن تم وضع الجنين وتوجيهه بشكل صحيح في الطبق الذي نشأ ، أصبحنا جاهزين لحقن البطين في الدماغ. أولا ، قم بترتيب إعداد المعالجة الدقيقة بحيث يكون طرف الإبرة في نفس مجال رؤية الجنين على طاقة عالية.

ضع الإبرة بعناية من خلال لوحة السقف الرقيقة للدماغ الخلفي خلف نقطة مفصلية واحدة R zero R دون ضرب أنسجة المخ أدناه ، وحقن ما يكفي من الصبغة لملء البطينين بالكامل. قد يستغرق الأمر عدة حقن لملء مساحة البطين اعتمادا على مرحلة الجنين. عندما يتم حقن الجنين ويكون جاهزا للتصوير ، يتم تحضير طبق أروس جديد للجنين.

باستخدام طبق نظيف مغطى بنسبة 1٪ ، قم بعمل ثقوب في الطبق وإزالة المقابس. انقل الجنين إلى الطبق وأضف التريكا لتخدير الجنين ومنع الحركة. ضع ذيل الجنين المحقون في البطين في الفتحة في موضعه للحصول على صورة ظهرية.

الجنين جاهز الآن للتصوير. التقط صورة باستخدام الضوء المنقول. من الأهمية بمكان عدم تحريك الجنين أو المجهر.

بعد ذلك ، قم بتغيير الإعدادات على المجهر والتقط صورة بضوء الفلورسنت. أعد وضع الجنين لالتقاط صور جانبية مع كل من الضوء المنقول وضوء الفلورسنت. احفظ جميع الصور في ملفات معالجة الصور في Photoshop.

لمعالجة الصور في Photoshop ، افتح صور الضوء الفلوري والضوء المنقول لنفس الجنين الذي تم التقاطه في نفس الموضع. تأكد من أن جميع الإعدادات متشابهة لكل صورة ، اسحب صورة الفلورسنت الخاصة بك إلى صورة الضوء المرسلة وقم بمحاذاتها تماما مع صورة الفلورسنت المحددة. حدد تعديلات الصورة، ثم استبدل اللون وقم بتغيير الخلفية السوداء إلى اللون الأبيض.

في نافذة استبدال الألوان ، اضبط عامل التعتيم على اليمين حتى تبدو الصورة الفلورية موحدة اللون. في نافذة الطبقات، حدد ضرب. لعرض صور التراكب، يجب أن تتطابق صورة مساحة البطين مع صورة الضوء المرسلة. بالضبط.

احفظ هذا الملف وكرر ذلك مع أي صور أخرى. إذا تم إجراء حقن البطين بشكل صحيح ، فيجب أن يكون للصور حواف حادة في صبغة غير منتشرة كما هو موضح هنا في هذه الصور لمدة 25 ساعة. بعد الإخصاب بينما تعرض لوحة الأجنة من النوع A صورة المجال الساطع ، وتعرض اللوحة B صورة الفلورسنت وتعرض اللوحة C صورة التراكب.

عرض جانبي لصورة التراكب في اللوحة D.من ناحية أخرى ، إذا تم إدخال الإبرة أثناء حقن البطين بعيدا جدا ، فسوف تدخل أنسجة المخ أسفل مساحة البطين وتؤدي إلى حقنة غير صحيحة. ينتج عن هذا صبغة مرئية خارج مساحة البطين وفي صفار البيض كما هو موضح هنا. تعرض اللوحة E صورة المجال الساطع.

تعرض اللوحة F صورة الفلورسنت وتعرض اللوحة G الصورة المتراكبة. يظهر عرض جانبي للصورة المتراكبة في اللوحة H ، وتشير الأسهم إلى المناطق التي تجاوزت فيها الصبغة مساحة بطين الدماغ. في هذا الفيديو، أوضحنا كيفية حقن صبغة الفلورسنت في بطينات دماغ أسماك الزرد النامية.

تستخدم هذه الطريقة لتصور مساحة البطين في الدماغ على عكس الظهارة العصبية المحيطة ، وهي مفيدة للغاية لتحديد شكل مساحة البطين وكذلك شكل أنسجة المخ المحيطة. تسمح لنا هذه التقنية بفهم عملية تكوين بطين الدماغ وتشكل الدماغ بمرور الوقت في الجنين الحي بشكل أفضل. إنها أداة ممتازة لدراسة عيوب تكوين البطين في الدماغ ، وللتوصيف الأولي لطفرات تشكل الدماغ.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.