الزرد حقن الدماغ البطين

تبدأ هذه العملية بتحديد المرحلة العمرية لأجنة أسماك الزيبرا. وعندما تصل الأجنة إلى المرحلة المطلوبة، يتم إخراجها من الغشاء الكوريوني. بعد ذلك، تُحدث ثقوب في طبق مطلي بمادة aros باستخدام رأس ماصة لتثبيت الأجنة، ثم توضع الأجنة برفق في الثقوب بحيث تكون ذيولها متجهة للأسفل.

بعد تثبيت الأجنة، يتم حقن صبغة فلورية بعناية في الحيز البطيني للجنين عبر الدماغ الخلفي. وبعد الحقن البطيني، يتم تصوير الأجنة ومعالجة البيانات باستخدام برنامج Photoshop. مرحباً، أنا جينيفر غوتمان من مختبر الدكتورة هازل سيف في معهد وايت هيد للأبحاث الطبية الحيوية في MIT في كامبريدج، ماساتشوستس.

سنعرض لكم اليوم إجراءً خاصاً بحقن بطينات دماغ سمكة الزيبرا. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تكوين بطينات الدماغ والتشكل المورفولوجي للنسيج العصبي الظهاري في أسماك الزيبرا الحية. ونظراً لطبيعة أجنة سمكة الزيبرا الشفافة، قد يكون توصيف شكل بطينات الدماغ أمراً صعباً.

تُعد هذه التقنية وسيلة مفيدة وبسيطة للتمييز بين الحيز المليء بالسوائل والأنسجة المحيطة، ولتوصيف الأجنة الطافرة التي قد تعاني من عيوب في تكوين بطينات الدماغ. لذا، فلنبدأ الآن. للتحضير لحقن بطين دماغ سمكة الزيبرا، نبدأ بصناعة إبر الحقن.

يُستخدم جهاز سحب الشعيرات (needle puller) من شركة Sutter لسحب الإبر الشعرية. ثم تُملأ الإبرة الشعرية بصبغة فلورية، مثل Texas red dextrin. بعد ذلك، يتم تركيب الإبرة المملوءة في مِتحكم دقيق (micro manipulator) ضمن جهاز الحقن المجهري.

اقطع الإبرة بزاوية للحصول على الحجم المناسب. ولإنشاء طرف مائل، قم بقياس حجم القطرة من الإبرة وتحقق من أنه يتراوح بين 1 إلى 2 nanoliters لكل حقنة في الزيت. لبدء مرحلة الإجراء هذه، ووفقًا لـ Kimmel، يجب حقن جميع الأجنة قبل 30 دقيقة من المرحلة المراد دراستها.

على سبيل المثال، لدراسة البطينات بعد 24 ساعة من الإخصاب، يتم حقن الأجنة بعد 23 ساعة ونصف من الإخصاب. يوضع الجنين في المرحلة المراد دراستها تحت المجهر المجسم، ويُزال الغشاء الكوريوني بعناية من الجنين باستخدام الملقط. بعد ذلك، يتم تحضير طبق aros للأجنة باستخدام طبق بلاستيكي مغطى بـ 1% aros، وتُحدث ثقوب في الـ aros باستخدام طرف ماصة بلاستيكية سعة 1 إلى 200 µL.

قم بإزالة سدادات aros من الثقوب بعناية باستخدام الملاقط. انقل الجنين ووسط نمو الأجنة إلى طبق aros ذو الثقوب. أضف trica إلى الوسط لتخدير الجنين ومنع حركته.

أثناء التجربة، ضع الجنين برفق بحيث يكون الذيل للأسفل داخل الفتحة، ووجهه بحيث تكون أداة الحقن على الجانب الخلفي من الجنين. الآن وبعد وضع الجنين وتوجيهه بشكل صحيح في طبق الأجاروز، أصبحنا مستعدين لعملية الحقن في بطين الدماغ. أولاً، قم بتجهيز إعدادات التلاعب الدقيق بحيث تكون طرف الإبرة في نفس مجال الرؤية الذي يظهر فيه الجنين تحت قوة تكبير عالية.

أدخل الإبرة بعناية عبر الصفيحة السقفية الرقيقة للدماغ الخلفي، خلف نقطة مفصل R zero R one مباشرةً دون لمس أنسجة الدماغ الموجودة أسفلها، ثم احقن كمية كافية من الصبغة لملء البطينات بالكامل. قد يتطلب الأمر عدة عمليات حقن لملء مساحة البطينات اعتماداً على مرحلة الجنين. وعندما يتم حقن الجنين ويصبح جاهزاً للتصوير، يتم تحضير طبق أجاروز جديد للجنين.

باستخدام طبق نظيف مطلي بـ 1%aros، قم بثقب ثقوب في الطبق وإزالة السدادات. انقل الجنين إلى الطبق وأضف trica لتخدير الجنين ومنع حركته. ضع ذيل الجنين الذي تم حقنه في البطين في الثقب في وضعية مناسبة لالتقاط صورة ظهرية.

أصبح الجنين الآن جاهزاً للتصوير. التقط صورة باستخدام الضوء النافذ. من الضروري جداً عدم تحريك الجنين أو المجهر.

بعد ذلك، قم بتغيير إعدادات المجهر والتقط صورة باستخدام الضوء الفلوري. أعد وضع الجنين لالتقاط صور جانبية باستخدام كل من الضوء النافذ والضوء الفلوري. احفظ جميع الصور في ملفات من أجل معالجة الصور باستخدام برنامج Photoshop.

لمعالجة الصور في برنامج Photoshop، افتح صور الضوء النافذ والضوء الفلوري لنفس الجنين والتي تم التقاطها في الموضع ذاته. تأكد من أن جميع الإعدادات متطابقة. لكل صورة، اسحب الصورة الفلورية فوق صورة الضوء النافذ وقم بمحاذاتهما بدقة مع تحديد الصورة الفلورية. اختر تعديلات الصور (image adjustments)، ثم استبدال اللون (replace color) وقم بتغيير الخلفية السوداء إلى اللون الأبيض.

في نافذة استبدال اللون، قم بضبط عامل التمويه (fuzziness) نحو اليمين حتى تبدو الصورة الفلورية موحدة اللون. في نافذة الطبقات، اختر "تضاعف" (multiply). لعرض الصور المتراكبة، يجب أن تتطابق صورة حيز البطين مع صورة الضوء النافذ تماماً.

احفظ هذا الملف وكرر العملية لأي صور أخرى. إذا تم إجراء الحقن البطيني بشكل صحيح، يجب أن تظهر الصور حوافاً حادة في الصبغة غير المنتشرة كما هو موضح هنا في هذه الصور بعد 25 hours من الإخصاب؛ حيث تظهر اللوحة A صورة الحقل المضيء، وتظهر اللوحة B الصورة الفلورية، وتظهر اللوحة C الصورة المتراكبة.

يظهر منظر جانبي للصورة المتراكبة في اللوحة D. من ناحية أخرى، إذا تم إدخال الإبرة بعمق زائد أثناء الحقن البطيني، فستخترق أنسجة الدماغ أسفل الحيز البطيني، مما يؤدي إلى حقن غير صحيح. وينتج عن ذلك ظهور الصبغة خارج الحيز البطيني وفي المح، كما هو موضح هنا. وتظهر اللوحة E صورة المجال المضيء.

يُظهر اللوح F الصورة الفلورية ويُظهر اللوح G الصورة المتراكبة. ويظهر عرض جانبي للصورة المتراكبة في اللوح H. تشير الأسهم إلى المناطق التي تجاوز فيها الصبغ مساحة بطين الدماغ. في هذا الفيديو، أوضحنا كيفية حقن الصبغ الفلوري في بطينات دماغ أسماك zebrafish النامية.

تُستخدم هذه الطريقة لتصوير حيز بطينات الدماغ تباينًا مع الظهارة العصبية المحيطة، وهي مفيدة للغاية في تحديد شكل حيز البطينات وكذلك شكل أنسجة الدماغ المحيطة. تتيح لنا هذه التقنية فهم عملية تكوين بطينات الدماغ وتشكل الدماغ بشكل أفضل بمرور الوقت في الجنين الحي. كما تُعد أداة ممتازة لدراسة عيوب تكوين بطينات الدماغ، وللتوصيف الأولي لطفرات تشكل الدماغ.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.