مقايسة لمسببات الأمراض ، المرتبطين نمط الجزيئية (PAMP) - الحفز الحصانة (كونا) في النباتات

مرحباً، أنا Suma TI من مختبر Greg Martin في معهد Voice Thompson لأبحاث النبات. سنعرض لكم اليوم إجراءً لمقايسة تعتمد على موت الخلايا للكشف عن المناعة التي يحفزها PAM، أو ما يعرف بـ PTI. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للبحث في مدى مشاركة جين معين في عملية PTI.

لنبدأ الآن. ابدأ الإجراء بزراعة نباتات Nicotiana ANA حتى يصل عمرها إلى نحو سبعة أسابيع، وذلك قبل أربعة إلى خمسة أيام من البدء.

مقايسة المناعة التي يحفزها النمط المرتبط بالمرض (PAM) أو مقايسة المناعة التي يحفزها النمط (PTI). قم بتقليم النباتات لإزالة جميع الفروع الإبطية والأزهار. حاول إزالة الفروع الإبطية فور ظهورها لجعل التعامل مع النباتات أكثر سهولة.

بعد تحضير النباتات، ابدأ في تنمية البكتيريا. يستخدم هذا الإجراء بكتيريا غير ممرضة لتحفيز مناعة النبات قبل التلقيح الثاني ببكتيريا التحدي، لذا ابدأ بتنمية جميع أنواع البكتيريا المستخدمة في المقايسة. في الوقت نفسه، استخدم مخزونات الجلسرين المجمدة من بكتيريا pseudomonas لكل سلالة بكتيرية من pseudomonas.

قم بتوزيع كمية صغيرة من البكتيريا في مركز طبق KBM يحتوي على المضاد الحيوي المناسب، ثم قم بحضن الطبق عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 18 إلى 24 ساعة تقريباً. بالنسبة لبكتيريا agrobacterium، استخدم طبقاً طازجاً تم تحضيره مسبقاً لبدء مزرعة سائلة في 2 مل من وسط lb. يتم استنبات المزرعة طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج في اليوم التالي.

أضف 150 إلى 200 µL من وسط KBM السائل إلى أطباق بكتيريا pseudomonas. قم بتوزيع البكتيريا على كامل الطبق باستخدام فردة (greter) معقمة.

أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة تتراوح بين 20 إلى 24 ساعة أخرى. ابدأ استنبات مزرعة ثانوية من agrobacterium في حوالي 5 إلى 10 مللي لتر من وسط LB الذي يحتوي على 20 micromolar من الأسيتون.

قم بتنمية المزرعة طوال الليل عند 30 degrees Celsius مع الرج. بعد تحضير البكتيريا، ابدأ في تحضير النباتات للفحص في اليوم السابق لإجراء فحص PTI. بعد تحضير البكتيريا، انقل النباتات إلى غرفة درجة حرارتها تتراوح بين 22 إلى 24 degrees Celsius مع رطوبة نسبية تبلغ حوالي 35 إلى 40% وإضاءة مستمرة.

بعد ذلك، استخدم قلماً أسود عريضاً لرسم دوائر على الأوراق. اختر الأوراق المتمددة جيداً وتجنب الأوراق القديمة أو الأوراق القاسية أو السميكة الملمس. وتجنب وضع العلامات على الأجزاء السفلية من الورقة.

يبلغ قطر الدوائر 1.5 سنتيمتر على الأقل، ويمكن تحديد دائرتين إلى أربع دوائر لكل ورقة. يجب أن تكون الدوائر متباعدة جيداً ويُفضل ألا تتقاطع مع وريد كبير. ابدأ مقايسة PTI عن طريق حصاد البكتيريا المستخدمة في تحفيز PTI.

يجب أن تكون أنواع الـ pseudomonas المستخدمة قد شكلت طبقة بكتيرية كثيفة تدل على نمو جيد. يتم حصادها من الطبق عن طريق كشطها باستخدام عود خشبي طويل ومعقم، ثم إعادة تعليقها في حوالي 20 إلى 25 ملليلتر من محلول كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 millimolar من أجل عملية الطرد المركزي للـ agrobacterium.

يتم جمع الخلايا من المزرعة وإعادة تعليقها في حوالي 20 إلى 25 مللي لتر من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 millimolar مضافاً إليه 10 millimolar من MES بتركيز pH 5.6، ثم كرر عملية الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا مرة أخرى في حوالي 20 إلى 25 مللي لتر من محلول كلوريد المغنيسيوم وMES. الآن وقد تمت إعادة تعليق بكتيريا pseudomonas وagrobacterium المحفزة.

قم بقياس الكثافة الضوئية لجميع المزارع الثلاث عند طول موجي قدره 600 نانومتر. قم بضبط قيم OD عن طريق تخفيف الخلايا باستخدام كلوريد المغنيسيوم لبكتيريا pseudomonas، ومحلول MES بالإضافة إلى كلوريد المغنيسيوم لبكتيريا agrobacterium. يمكن العثور على قيم OD النهائية المطلوبة في البروتوكول المكتوب المرفق.

تعتبر كمية إجمالية قدرها 25 ملليلتر من المزرعة البكتيرية كافية لتلقيح ما يقرب من 40 إلى 50 بقعة. ابدأ الآن المقايسة عن طريق ترشيح محفزات PTI في الدوائر المحددة مسبقاً على الأوراق باستخدام محقنة سعة ملليلتر واحد بدون إبرة. دوّن الترتيب الذي تم به ترشيح النباتات والوقت الدقيق الذي بدأ فيه الترشيح بعد عملية التحفيز.

انتقل إلى التلقيح بالتحدي بعد عدة ساعات من التلقيح التحريضي. قم بحصاد السلالات البكتيرية المطلوبة للتلقيح بالتحدي كما تم توضيحه سابقاً لسلالات الـ pseudomonas التحريضية. مرة أخرى، قم بقياس الـ OD وضبط تركيز المزارع وفقاً لبروتوكول GR المرفق.

ابدأ بالتلقيح التحدي بعد سبع ساعات من ترشيح المادة المحفزة. استخدم توليفات المحفز والمادة المحدية التالية. اختر نقطة على محيط دائرة التلقيح الأولى لتكون مركزاً لدائرة التلقيح الثانية.

قم بإجراء عملية الترشيح للتحدي بنفس ترتيب النباتات الذي تم استخدامه في عملية الحث. في حال وجود عدة بقع على الورقة، تأكد من عدم تداخل عمليات الترشيح. وأخيرًا، قم بزراعة تخفيفات تسلسلية من جميع المزارع المستخدمة في المقايسة على أطباق KBM أو LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة.

بعد يومين من التلقيح بالتحدي، يمكن البدء في تقييم استجابة المناعة الموجهة بالأنماط (PTI). بعد يومين من التلقيحات التحريضية والتحدي، ابحث عن ظهور موت الخلايا الناتج عن المناعة المحفزة بالمؤثرات (ETI) في البقع التي تم تحديها باستخدام PST DC 3000؛ حيث يشير موت الخلايا داخل منطقة التداخل في الارتشاح إلى انهيار الـ PTI ويجب تسجيله كنمط ظاهري إيجابي. بعد أربعة إلى خمسة أيام من التلقيحات التحريضية والتحدي، ابحث عن ظهور موت الخلايا الناتج عن المرض في البقع التي تم تحديها باستخدام طفرة DC 3000 hop Q1 أو PS back high. ابحث مجدداً عن انهيار الـ PTI والذي يستدل عليه بموت الخلايا الناتج عن المرض في منطقة التداخل في الارتشاح. استمر في مراقبة النباتات حتى تبدأ تلك التي لم يصبها خلل في الـ PTI في إظهار موت الخلايا في منطقة التداخل في الارتشاح.

تعاني النباتات التي تم إسكات جين FLS two فيها من خلل في الاستجابة المناعية PTI بعد يومين من التلقيح بمزيج PFDC. ويظهر موت الخلايا في المنطقة المتداخلة، مما يشير إلى انهيار في تحكم PTI. أما النباتات الضابطة التي لم يتم إسكات أي جين فيها، فقد تم تلقيحها أيضاً بمزيج PFDC وفحصها بعد يومين من إجراء المقايسة، حيث لوحظ موت الخلايا الناتج عن التحدي خارج المنطقة المتداخلة وليس بداخلها، وذلك بسبب استجابة PTI الطبيعية.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة تعتمد على موت الخلايا لقياس المناعة التي يحفزها النمط PAMP أو PTI. ومن المهم أثناء تنفيذ هذا الإجراء تذكر الحفاظ على النباتات في الظروف البيئية التي نوصي بها؛ حيث إن المستويات المرتفعة من الرطوبة ستؤثر سلباً على النباتات وتجعل المقايسة تتقدم بسرعة أكبر.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.