مقايسة لمسببات الأمراض ، المرتبطين نمط الجزيئية (PAMP) - الحفز الحصانة (كونا) في النباتات

مرحبا ، أنا سوما تي آي من مختبر جريج مارتن في معهد فويس طومسون لأبحاث النبات. سنعرض لك اليوم إجراء لفحص الموت الخلوي للمناعة التي تسببت فيها PAM أو PTI. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للبحث عن تورط الجين في PTI.

لذلك دعونا نبدأ. ابدأ الإجراء بزراعة Nicotiana ANA حتى يبلغ عمرها حوالي سبعة أسابيع. قبل أربعة إلى خمسة أيام من البدء.

PAM إلى اختبار المناعة أو اختبار PTI. تقليم النباتات لإزالة جميع الفروع الإبطية والزهور. حاول إزالة الفروع الإبطية بعد فترة وجيزة من ظهورها لجعل النباتات أكثر قابلية للإدارة.

بعد تحضير النباتات ، انتقل إلى زراعة البكتيريا. يستخدم هذا الإجراء البكتيريا غير المسببة للأمراض لتحريض مناعة النبات قبل التلقيح الثاني ببكتيريا التحدي ، وبدء نمو جميع البكتيريا المستخدمة في الفحص. في الوقت نفسه ، استخدم سيقان الجلسرين المجمدة من بكتيريا pseudomonas لكل ساق بكتيرية pseudomonas.

انشر كمية صغيرة من البكتيريا في وسط صفيحة كيلو بايت في الدقيقة التي تحتوي على المضاد الحيوي المناسب واحتضان الصفيحة عند 30 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة تقريبا. بالنسبة للبكتيريا الزراعية ، استخدم صفيحة طازجة معدة مسبقا لبدء زراعة سائلة في ملليلترين من الرطل. تنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز في اليوم التالي.

أضف 150 إلى 200 ميكرولتر من KBM السائل إلى ألواح بكتيريا pseudomonas. انشر البكتيريا على الطبق بأكمله. باستخدام جريتر معقم.

ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 20 إلى 24 ساعة أخرى. أربع بكتيريا زراعية. ابدأ مزرعة ثانوية في حوالي خمسة إلى 10 ملليلتر من LB تحتوي على 20 ميكرومولار أسيتون.

قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الرج. بعد تحضير البكتيريا ، انتقل إلى تحضير النباتات للفحص في اليوم السابق لإجراء فحص PTI. بعد تحضير البكتيريا ، انقل النباتات إلى غرفة من 22 إلى 24 درجة مئوية مع ما يقرب من 35 إلى 40٪ رطوبة نسبية وضوء ثابت.

بعد ذلك ، استخدم علامة سوداء سميكة لتمييز الدوائر على الأوراق. اختر أوراقا موسعة جيدا وتجنب الأوراق القديمة أو الأوراق القاسية أو السميكة الملمس. تجنب وضع علامات على الأجزاء السفلية من الورقة.

قطر الدوائر 1.5 سم على الأقل ويمكن تمييز دائرتين إلى أربع دوائر لكل ورقة. يجب أن تكون الدوائر متباعدة جيدا ويفضل ألا تعبر وريدا كبيرا. ابدأ اختبار PTI عن طريق حصاد البكتيريا المستخدمة في تحريض PTI.

يجب أن تكون الأنواع الكاذبة المستخدمة قد شكلت عشبا بكتيريا يدل على نمو جيد. احصدها من الطبق عن طريق كشطها بعصا خشبية طويلة معقمة وإعادة تعليقها في حوالي 20 إلى 25 مل من 10 ملليمول. محلول كلوريد المغنيسيوم لأجهزة الطرد المركزي الزراعية.

يتم تعليق الثقافة لجمع الخلايا وإعادة التركيب في حوالي 20 إلى 25 مل من 10 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم بالإضافة إلى 10 ملليمولار. MES الرقم الهيدروجيني 5.6 ، كرر الطرد المركزي ومرة أخرى ، قم بتعليق النسخ في حوالي 20 إلى 25 مل من محلول كلوريد المغنيسيوم بالإضافة إلى MES. الآن بعد أن تم تعليق البكتيريا الكاذبة والبكتيريا الزراعية المحفزة.

قم بقياس الكثافة البصرية لجميع الثقافات الثلاث بطول موجي يبلغ 600 نانومتر. اضبط المواد المستنفدة للأوزون عن طريق تخفيف الخلايا بكلوريد المغنيسيوم للكاذبة و MES بالإضافة إلى كلوريد المغنيسيوم للبكتيريا الزراعية. تم العثور على قيم OD النهائية المطلوبة في البروتوكول المكتوب المصاحب.

الحجم الإجمالي البالغ 25 مل من الثقافة البكتيرية يكفي لتلقيح حوالي 40 إلى 50 بقعة. ابدأ الآن الفحص عن طريق التسلل إلى محفزات PTI في الدوائر المحددة مسبقا على الأوراق باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد بدون إبرة. اكتب الترتيب الذي تم به تسلل النباتات والوقت المحدد الذي بدأ فيه التسلل بعد التحريض.

انتقل إلى التلقيح التحدي بعد عدة ساعات من التلقيح التعريفي. حصاد السلالات البكتيرية المطلوبة للتلقيح التحدي كما هو موضح سابقا لسلالات pseudomonas المحفزة. مرة أخرى ، قم بقياس OD وضبط تركيز المزارع وفقا لبروتوكول الموارد الوراثية المصاحب.

ابدأ التلقيح التحدي بعد سبع ساعات من تسلل المحفز. استخدم مجموعات المحرض المتحدية التالية. اختر نقطة على محيط دائرة التلقيح الأولى كمركز لدائرة التلقيح الثانية.

قم بإجراء تسلل التحدي بنفس ترتيب النباتات مثل الحث. إذا كانت هناك بقع متعددة على الورقة ، فتأكد من عدم تداخل التسلل. أخيرا ، التخفيف التسلسلي للوحة لجميع الثقافات المستخدمة في الفحص على لوحات KBM أو LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة.

بعد يومين من تلقيح التحدي ، يمكن للمرء أن يبدأ في تقييم استجابة PTI بعد يومين من التحريض والتحدي ، والبحث عن ظهور موت الخلايا بسبب المناعة التي تحفزها المستجيب أو ETI في البقع التي تم تحديها مع PST DC 3000 موت الخلايا داخل منطقة التسلل المتداخلة ، مما يشير إلى انهيار PTI ويجب تسجيله كنمط ظاهري إيجابي بعد أربعة إلى خمسة أيام من التحريض والتحدي تبحث التطعيمات عن ظهور موت الخلايا بسبب المرض في البقع التي تم تحديها مع DC 3000 hop Q1 المتحولة أو PS مرة أخرى. ابحث عن انهيار PTI الذي يشار إليه بموت الخلايا بسبب المرض في منطقة التسلل المتداخلة. استمر في مراقبة النباتات حتى تبدأ تلك التي لم يتم المساس بها ل PTI في إظهار موت الخلايا في منطقة التسلل المتداخلة.

يتم اختراق النباتات التي تم إسكاتها ل FLS two ل PTI بعد يومين من التلقيح بتركيبة PFDC. يظهر موت الخلايا في المنطقة المتداخلة مما يشير إلى انهيار نباتات التحكم في PTI التي لم يتم إسكاتها لأي جين. تم تلقيحها أيضا بتركيبة PFDC وفحصها بعد يومين من إجراء موت خلية الفحص بسبب التحدي الذي شوهد في الخارج ولكن ليس داخل المنطقة المتداخلة بسبب استجابة PTI الطبيعية.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء فحص قائم على موت الخلايا للمناعة الناجمة عن البنطال أو PTI أثناء القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر إبقاء النباتات في الظروف البيئية التي نوصي بها. ستؤثر مستويات الرطوبة المرتفعة سلبا على النباتات وتجعل الفحص يسير بسرعة أكبر.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.