هندسة الخلايا المنفذة للبروتين

يمكن تحقيق التحكم في الوظائف الخلوية من خلال المنهجيات التقليدية المتمثلة في ترانسفكشن (transfection) الحمض النووي DNA أو ترانسداكشن (transduction) الفيروسات خلال السنوات الخمس عشرة الماضية. وقد تطورت طريقة أخرى، وهي ترانسداكشن البروتين (protein transduction)، حيث يمكن إيصال البروتين النشط بيولوجياً بشكل مباشر إلى الخلايا الثديية باستخدام ببتيدات صغيرة مدمجة مع البروتين المستهدف، مما يعزز من عملية الامتصاص الخلوي.

بما أنه لا يتم استخدام أي DNA، فإن خطر حدوث تشوه في التكوين يتم تلافيه. وبخلاف الطرق التقليدية المذكورة أعلاه، يتيح نقل البروتين إيصال البروتينات بطريقة قابلة للعيار.

علاوة على ذلك، يمكن تعديل المجموعات الخلوية الصغيرة وكذلك الخلايا غير المنقسمة، مثل العصبونات ما بعد الانقسام الفتيلي. وللتعبير عن البروتين المأشوب بطريقة فعالة، نوصي باستخدام نظام ناقل Paciz، وهو نظام ناقل معياري يتكون من متغير للنهاية الطرفية ونوع لـ C terminal.

يسمح كلا الناقلين بإدراج الجين المستهدف بسهولة لغرض التنقية. وقد تم دمج وسم الهيستيدين بالإضافة إلى نطاق نقل البروتين. وفي حالتنا هذه، تم استخدام نطاق من فيروس HI لتعزيز الامتصاص الخلوي من أجل التوزيع الخلوي.

تكتمل الناقلة بوجود إشارة توطين نووية، ولأسباب تتعلق بالتحكم، يمكن ببساطة إزالة وسوم الاندماج. علاوة على ذلك، يمكن أن يكون لترتيب هذه الوسوم تأثير كبير على خصائص بروتينات الاندماج. كما أن التأثير على الإنتاجية والنقاء، بالإضافة إلى القابلية للبيع والوظيفة البيولوجية، ليس أمراً يمكن التنبؤ به.

مرحباً، اسمي برنارد موس وأعمل في مجموعة هندسة الخلايا الجذعية في معهد إعادة التأهيل العصبي في بوند، ألمانيا. مرحباً، اسمي كريستوف ب وأنا أيضاً عضو في مختبر هوفر. تستخدم مجموعتنا البحثية تقنية نقل البروتين بشكل مكثف لإيصال البروتينات النشطة بيولوجياً مباشرة إلى مختلف الخلايا الثديية، واليوم نريد إرشادكم خلال عملية التعبير والتنقية في ومن e coli.

بعد ذلك، نود أن نوضح لكم كيفية تطبيق بروتين الاندماج الدائم في المزارع الخلوية لتوضيح الإجراء الكامل للتعبير والتنقية والتطبيق. سنستخدم إعادة التركيب المحددة للموقع Cree لتعديل الخلايا الجذعية الورمية للفئران وراثياً. حسناً. حسناً. فلنبدأ.

لتلقيح المزرعة الليلية، نستخدم بكتيريا محولة مسبقاً ومخزنة في مخزون جليسرول عند درجة حرارة -80 °C. تحتوي هذه البكتيريا بالفعل على الناقل الذي يشفر لـ decre recombination. وباستخدام طرف ماصة، نقوم بكشط كمية صغيرة من البكتيريا على طرف الماصة ثم نضعها في الكأس الذي يحتوي على المزرعة الليلية.

تتكون المزرعة الليلية من وسط LB مُدعم بالجلوكوز بتركيز نهائي قدره 0.5% و 50 micrograms من الإنسولين الكربوني لكل ml. ثم يُوضع الكأس في حاضنة تعمل عند 37 degree centigrade للتعبير عن إنزيم Recombinate Cree المحدد للموقع. نحن نستخدم وسط TB مُدفأ مسبقاً لمزرعة التعبير واسعة النطاق.

لتسريع عملية التعبير، نوصي باستخدام وسط TB المسخن إلى 37 °C، وهي درجة الحرارة المستخدمة أثناء التعبير عن البروتين المأشوب. بعد ذلك، نضيف الجلوكوز إلى وسط TB بتركيز نهائي قدره 0.5%. يمنع الجلوكوز زيادة التعبير الأساسي لبروتين الاندماج أثناء نمو مستنبت التعبير قبل عملية الحث. وأخيراً، يُضاف الأمبيسيلين إلى مستنبت التعبير بتركيز نهائي قدره 100 µg/ml لضمان الحصول على مستنبت نقي يحتوي فقط على البكتيريا التي لا تزال تحمل البلازميد المشفر للبروتين المطلوب.

يمكننا الآن الحصول على المزرعة الليلية وتلقيح مزرعة التعبير بنسبة 1 إلى 50. ثم تُنقل الدوارق إلى حاضنة تعمل عند درجة حرارة 37 °C. يجب أخذ عينات لقياس الكثافة الضوئية بشكل منتظم طوال فترة التعبير.

بمجرد أن تصل المزرعة إلى كثافة بصرية تبلغ 1.5، يتم تحفيز البكتيريا بتركيز نهائي قدره 0.5 millimolar من IPTG. وبعد مرور ساعة واحدة من التحفيز، تُنقل مزرعة التعبير إلى أنابيب ثم تُحصَد عن طريق الطرد المركزي. ولهذا الغرض، نستخدم دوار SLA 3000.

يتم تشغيل جهاز الطرد المركزي بسرعة 5,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم التخلص من السائل الطافي، ويمكن تخزين كتلة البكتيريا المترسبة لفترة غير محدودة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. يتم بعد ذلك إعادة تعليق الكتل المجمدة في محلول lizza المنظم، بكمية تعادل لترًا واحدًا من مستنبت التعبير.

نستخدم 10 mls من محلول lizza المنظم، وننتظر لمدة 15 دقيقة تقريباً حتى يصبح المحلول متجانساً. ثم يتم إضافة ملليغرام واحد من lysozyme لكل ML من المعلق. ويُخلط المحلول لمدة 20 دقيقة للسماح للإنزيم بتكسير جدران البكتيريا.

بعد ذلك، يُضاف Benson Nase بتخفيف بنسبة 1 إلى 1000 لمدة 15 دقيقة إضافية، مما سيؤدي إلى قطع الـ DNA لينتج محلول غير لزج. وأخيراً، يُستخدم جهاز sonicator لضمان تحلل الخلايا. يتم تشغيل البرنامج لمدة دقيقة ونصف بقدرة 45% بعد إتمام عملية التحقق.

تذكر أخذ عينة من كل خطوة هنا، سواء كانت المستخلص الخام أو تحليل SDS page للتنقية. من المهم جداً الآن إضافة 1 ml من محلول TSB المنظم المبرد بالثلج لكل 1 ML من المعلق، حيث يميل البروتين المترسب إلى الترسيب داخل مخزون الجلسرول. إذا كنت ستتجاوز هذه الخطوة، يتم خلط المحلول لفترة وجيزة ويصبح المستخلص الخام الآن جاهزاً للطرد المركزي.

لهذا الغرض، نستخدم دواراً من نوع SS 34. يتم تشغيل جهاز الطرد المركزي بسرعة 17,000 RPM لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وعند الانتهاء، يتم نقل السائل العلوي بعناية إلى أنابيب Falcon جديدة سعة 50 ml.

أضف الآن ملاط النيكل المضاد A إلى السائل الطافي. يعد النيكل المضاد A كاشفاً أساسياً للتنقية الصحيحة لبروتينات الاندماج ذات ذيل الهيستيدين. حيث يشكل الهيستيدين معقداً مع أيونات النيكل مما يسمح بالتنقية بالألفة، والآن قم برج أنابيب سنترفيوج بلطف لمدة 60 دقيقة عند 40 درجة مئوية.

بعد مرور ساعة واحدة، يمكنك الآن وضع المعلق على أعمدة سعة 20 ML والسماح للمحلول بالتدفق عبر الجاذبية. بالنسبة للإنتاجات واسعة النطاق، يمكن تقسيم المعلق على عدة أعمدة. بعد ذلك، نقوم بغسل العمود مرتين باستخدام محلول منظم يحتوي على 15 millimolar من innersole.

تعتمد كمية المنظم المستخدمة على حجم الراتنج. يقابل كل 1 mL من نيكل NTA مقدار 1 ml من الراتنج لأغراض الغسيل. نضع خمسة أحجام من راتنج منظم الغسيل على العمود، وبعد الغسيل، نصبح الآن مستعدين لاستخلاص البروتين الخاص بنا.

وبناءً على ذلك، نستخدم محلول شطف بتركيز 250 millimolar من الإيمونو. لاحظ كيف يتغير لون الراتنج نحو اللون الأخضر. ونظراً للتراكيز العالية لبروتين CRE، فإن جزء OID يصبح عكراً في بعض الأحيان.

ولمنع حدوث ذلك، اخلط المحلول وأضف المزيد من منظم التحلل (lys buffer)، حيث يتم الآن تجميع كافة الأجزاء ونقلها لاحقاً إلى أنبوب التحلل. سيعمل التحلل على إزالة الزيت، وتُجرى خطوة الديلزة الأولى مقابل منظم يحتوي على تركيز عالٍ من الملح. وبعد مرور ساعة واحدة، يتم استبدال منظم الملح العالي وتطبيق إجراء الديلزة طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم إخراج أنابيب الديلزة من محلول منظم عالي الملوحة ونقلها إلى محلول منظم من الجلسرول. وبعد مرور ثلاث إلى خمس ساعات، يتم استبدال محلول الجلسرول المنظم وإجراء عملية الديلزة مرة أخرى طوال الليل. سيؤدي التحلل في مقابل محلول الجلسرول المنظم إلى الحصول على محلول مخزون مركز بمقدار ثلاث مرات على الأقل.

يمكن الآن تخزين المحلول المخزون عند درجة حرارة 20- °C لعدة سنوات دون فقدان النشاط. ولضمان الجودة، يمكنك تحميل عينات SDS page التي جمعتها على هلام (gel) ثم صبغها لاحقاً. بالنسبة لـ Kamasi، يمكن الكشف عن البروتين الاندماجي Cree كحزمة بارزة في جزء OID. ومن أجل استخدام التركيز المناسب من crew recombination، يجب عليك تحديد التركيز عبر مقايسة Redford.

كيفية تطبيق البروتينات الدائمة في الخلايا الثديية. أولاً، قم بتحضير الخلايا المستهدفة من أجل تحقيق أعلى كفاءات لنقل البروتين. بالنسبة للخلايا ذات الطبقة الواحدة، اجعل كثافتها تؤدي إلى تكوين طبقة خلوية بنسبة تلاقي تتراوح من 80 إلى 90% في اليوم التالي، وفي حال كانت الخلايا المستهدفة هي خلايا YES، والتي تنمو في مستعمرات متراصة.

افصل الخلايا جسدياً وجهزها في شكل معلق خلوي أحادي قبل خمس ساعات. من المهم تحضير معلق خلوي أحادي قبل عملية نقل البروتين، وإلا فإن الخلايا السطحية للمستعمرة فقط هي التي سيتم نقل البروتين إليها. اسحب الوسط المزرعي وافحص الخلايا الهوائية لفترة وجيزة باستخدام PPS قبل البدء في العلاج.

قم بإزالة ما تبقى من الوسط الغذائي الخام الذي يحتوي على المصل. بعد شفط طبقة الخلايا العلوية من الـ PPS، اترك الخلايا تتقطر واتركها تحضن لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. الآن، تحقق باستخدام المجهر مما إذا كانت جميع المستعمرات قد تحللت إلى خلايا مفردة.

للأسباب المذكورة آنفاً، تعد هذه خطوة حاسمة لنقل البروتين إلى خلايا yes. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب. ضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وقم بتدوير الخلايا لترسيبها، ثم اسحب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا.

يتم تخفيف الخلايا في أوساط النمو للوصول إلى عدد الخلايا المناسب، وهو ما يعتمد بالطبع على حجم مزرعة الأنسجة. تُحضن الخلايا في الطبق لمدة خمس ساعات إضافية.

سيعطي هذا الخلايا الهوائية وقتاً كافياً للالتصاق بالقاع والنمو كخلايا ملتصقة. يمكن تخزين المخزون من صفوف الفئات الثلاث في درجة حرارة 20- درجة مئوية لأكثر من عامين. عند العمل مع بروتين اندماجي دائم من خلايا معاد تركيبها، يكون من المفيد جداً توفر محلول مخزون كهذا يمكن استخدامه عند الطلب.

أثناء انتظار التصاق الخلايا بالطبق، يمكن تحضير وسط نقل C ببساطة عن طريق تخفيف حجم مناسب من بروتين cell permanent creep من مخزون cholesterol في الوسط الخاص بك. وبما أن المحلول المخزني لـ Clare ليس معقماً بعد، فيجب ترشيح وسط النقل تعقيمياً قبل استخدامه. ونوصي باستخدام حقنة يمكن ربطها بمرشح ربط البروتين lobe.

يعتمد التركيز النهائي لـ creek على نوع الخلايا أو مكملات الوسط الغذائي. فعلى سبيل المثال، يكون للمصل تأثير سلبي قوي على كفاءة ترانسدكشن. ويمكن التغلب على ذلك باستخدام أوساط خالية من المصل أو عن طريق زيادة تركيز creek.

لقد حددنا الظروف المثلى التي تتيح أعلى كفاءة لإعادة الارتباط. قم بترطيب تركيز المادة بدءاً من 0.5 وصولاً إلى 10 micromolar. نوصي باختبار فترات تحضين مختلفة تتراوح بين ست و18 ساعة.

بعد خمس ساعات من الحضن، أخرج الخلايا المستهدفة وقم بشفط الوسط المتقاطع. بعد ذلك، نستبدله بوسط نقل البروتين، ثم نضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة للحضن طوال الليل. اغسل خلايا D باختصار باستخدام PPS وقم بتغيير وسط نقل البروتين إلى وسط ES العادي.

بعد مرور 48 ساعة من حضن الخلايا، يمكن الكشف عن التعبير الجيني الدائم لـ Cree عبر xul. وتعتبر الخلايا المصبوغة التي تظهر نمطًا ظاهريًا إيجابيًا لـ bega قد تمت هندستها وراثيًا بنجاح عن طريق إعادة التركيب المحددة للموقع. Cree التقرير.

تحتوي الخلايا على إنزيم CRE وتستخدم بنية Lae بعد إعادة التركيب الوسيطة. يتم استئصال تسلسل إيقاف محاط بـ P lock ويتم تنشيط جين المراسل luxe الذي يحركه محفز team. ومن أجل تقييم كفاءة إعادة التركيب في خلايا المراسل التي تمت معالجتها مسبقاً، يجب تثبيت الخلايا.

اشفط وسط الزراعة واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS، ثم غطِّ الخلايا بـ 4% PFA واحضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد شفط PBS من خطوة الغسيل الأخيرة، أضف محلول Xal Stain إلى الآبار واحضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة في الحاضنة.

في اليوم التالي، يمكن مراقبة نشاط Beal من خلال الخلايا ذات الطوق الأزرق. ويمكن تحديد كفاءة إعادة التركيب من خلال عدد المستعمرات الزرقاء. في ظل الظروف المثلى، يجب أن تكون قادرًا على تحقيق كفاءة إعادة تركيب تزيد عن 90% حسناً، لقد أظهرنا لكم اليوم كيفية التعبير عن إعادة التركيب المحددة للموقع وتنقيته من e coli.

في هذه الدراسة لإثبات المبدأ، تمكنا من تحفيز عملية إعادة الاندماج في معظم الأملاح. حسناً، هذا كل شيء. حظاً موفقاً في تجاربكم.