هندسة الخلايا المنفذة للبروتين

يمكن تحقيق التلاعب بالوظيفة الخلوية من خلال الأساليب الكلاسيكية لتعداء الحمض النووي أو نقل الفيروس خلال السنوات ال 15 الماضية. تطورت طريقة أخرى. يمكن توصيل البروتين النشط البيولوجي لنقل البروتين مباشرة إلى خلايا الثدييات باستخدام الببتيدات الصغيرة المدمجة في البروتين محل الاهتمام ، مما يعزز امتصاص الخلايا.

نظرا لعدم استخدام الحمض النووي ، يتم منع خطر عدم تكوين المجهود. على عكس الأساليب الكلاسيكية المذكورة أعلاه. يتيح نقل البروتين توصيل البروتينات بطريقة قابلة للمعايرة.

علاوة على ذلك ، يمكن تعديل مجموعات الخلايا الصغيرة وكذلك الخلايا غير المنقسمة ، مثل الخلايا العصبية بعد الانقسام. للتعبير عن البروتين المؤتلف بطريقة فعالة ، نوصي باستخدام نظام ناقل Paciz. إنه نظام متجه معياري يتكون من طرف طرفي ومتغير طرفي C.

يسمح كلا الناقلين بإدخال الجين الذي يثير اهتمامك بسهولة لوسائل التنقية. تم دمج علامة الهيستيدين بالإضافة إلى مجال نقل البروتين. في حالتنا ، المس من فيروس HI يعزز الامتصاص الخلوي للتوزيع الخلوي.

تكمل إشارة التوطين النووي المتجه لأسباب تتعلق بالتحكم ، ويمكن ببساطة إزالة علامات الاندماج. إلى جانب ذلك ، يمكن أن يكون لترتيب هذه العلامات تأثير كبير على خصائص بروتينات الاندماج. لا يمكن التنبؤ بالتأثير على المحصول والنقاء وكذلك قابلية البيع والوظيفة البيولوجية.

مرحبا ، اسمي برنارد موس وأنا أعمل في مجموعة هندسة الخلايا الجذعية في معهد علم الأعصاب الترميمي في بوند ، ألمانيا. مرحبا ، اسمي كريستوف ب وأنا أيضا عضو في مختبر هوفر. تستغل مجموعة العمل لدينا بشكل مكثف تقنية نقل البروتين لتوصيل البروتين البيولوجي النشط مباشرة إلى خلايا الثدييات المختلفة ، واليوم نريد إرشادك خلال عملية التعبير والتنقية داخل وإلى الإشريكية القولونية.

بعد ذلك ، نود أن نوضح لك كيفية تطبيق بروتين الاندماج الدائم للخلية في زراعة الخلايا لتجسيد التعبير عن الإجراء بالكامل وتنقيتها وتطبيقها. نحن نستفيد من إعادة تركيب Cree الخاصة بالموقع لتعديل الخلايا الجذعية العقدية للفأر وراثيا. حسنا، حسنا. هيا بنا نبدأ.

لتلقيح الثقافة بين عشية وضحاها ، نستخدم البكتيريا المحولة بالفعل المخزنة في مخزون الجلسرين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تحتوي هذه البكتيريا بالفعل على ترميز المتجه لإعادة تركيب decre. باستخدام طرف المزرمار ، نخدش كمية صغيرة من البكتيريا على طرف الممار ونسقطها في الدورق الذي يحتوي على الثقافة الليلية.

تتكون المزرعة الليلية من وسائط LB مكملة بالجلوكوز بتركيز نهائي من oh 0.5٪ و 50 ميكروغرام من الأنسولين الكربوني لكل مل. ثم يتم وضع الدورق في حاضنة تعمل عند 37 درجة مئوية للتعبير عن Recombinate Cree الخاص بالموقع. نحن نستخدم وسائط السل قبل الحرب لثقافة التعبير على نطاق واسع.

لتسريع التعبير ، نوصي باستخدام وسائط السل التي تم تسخينها حتى 37 درجة مئوية ، والتي تمثل درجة الحرارة أثناء التعبير عن البروتين المؤتلف. بعد ذلك ، نضيف الجلوكوز إلى وسط السل بتركيز نهائي من oh 0.5٪ يمنع الجلوكوز زيادة التعبير القاعدي لبروتين الاندماج أثناء نمو ثقافة التعبير قبل الحث. أخيرا ، يضاف الأمبيسلين إلى ثقافة التعبير بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام لكل مل لضمان ثقافة نقية تحتوي فقط على البكتيريا التي لا تزال تؤوي ترميز البلازميد لبروتين المرسوم.

يمكننا الآن الحصول على ثقافتنا بين عشية وضحاها وتطعيم ثقافة التعبير بنسبة واحد إلى 50. ثم يتم نقل الأكواب إلى حاضنة تعمل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يجب أن تأخذ عينات لقياس الكثافة البصرية بشكل منتظم طوال التعبير.

بمجرد أن تصل الثقافة إلى كثافة بصرية تبلغ 1.5 ، يتم تحفيز البكتيريا بتركيز نهائي يبلغ 0.5 مللي مولار من IPTG. بعد ساعة واحدة من الحث ، يتم نقل ثقافة التعبير إلى أنابيب ثم يتم حصادها لاحقا عن طريق الطرد المركزي. لهذا الغرض ، نستخدم دوار SLA 3000.

جهاز الطرد المركزي بسرعة 5،000 طلقة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات متقدمة. ثم يتم التخلص من snat ويمكن تخزين حبيبات البكتيريا إلى أجل غير مسمى عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. يتم تعليق الكريات المجمدة في عازلة ليزا ، وهي استئناف يتوافق مع لتر واحد من ثقافة التعبير.

نستخدم 10 مل من عازلة ليزا ، وانتظر حوالي 15 دقيقة حتى يصبح المحلول متجانسا. ثم يضاف ملليغرام واحد من الليزوزيم لكل مل من المعلق. يتم خلط المحلول لمدة 20 دقيقة للسماح للإنزيم بكسر البكتيريا.

بعد ذلك ، تتم إضافة Benson Nase في تخفيف من واحد إلى 1000 لمدة 15 دقيقة إضافية ، مما يؤدي إلى قطع الحمض النووي مما ينتج عنه محلول غير لزج. أخيرا ، يتم استخدام ابن لضمان تحلل الخلايا. يعمل البرنامج لمدة دقيقة ونصف بقوة 45٪ بعد الانتهاء من الشهادة.

تذكر أن تأخذ عينة من كل خطوة هنا ، تحليل صفحة المحللة الخام أو SDS للتنقية. من المهم الآن حقا إضافة مل واحد من محلول TSB المثلج البارد لكل مل من المعلق لأن بروتين المرسوم يميل إلى الترسيب داخل مخزون الجلسرين. إذا كنت ستتخطى هذه الخطوة ، خلط الحل قريبا وأصبح الخام جاهزا الآن للطرد المركزي.

لهذا الغرض ، نستخدم دوار SS 34. يعمل جهاز الطرد المركزي بسرعة 17,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. عند الانتهاء ، نقلت شركة الطرد المركزي بعناية المادة الطافية S إلى أنابيب فالكون جديدة سعة 50 مل.

أضف الآن ملاط النيكل المضاد A إلى النيكل الطافي. Anti A هو كاشف حاسم للتنقية المناسبة لبروتينات اندماج تقنية الهيستيدين. يشكل الهيستيدين مركبا مع أيونات النيكل التي تتيح تنقية التقارب الآن بهز أنابيب وقوف السيارات برفق لمدة 60 دقيقة على 40 درجة مئوية.

بعد ساعة واحدة ، يمكنك الآن تطبيق التعليق على عمود 20 مل والسماح للمحلول بالمرور عن طريق تدفق الجاذبية. بالنسبة للإنتاج على نطاق واسع ، من الممكن تقسيم التعليق إلى عدة أعمدة. ثم نقوم بغسل العمود مرتين بمخزن مؤقت يحتوي على 15 ملليمولار من النعل الداخلي.

مقدار المخزن المؤقت المطبق على حجم الراتنج. يتوافق اثنان من MLS من النيكل NTA مع مل واحد من الراتنج لوسائل الغسيل. نضع خمسة أحجام من الراتنج من مخزن الغسيل المؤقت على العمود بعد الغسيل ، ونحن الآن مستعدون للتهرب من البروتين لدينا.

لذلك ، نستخدم مخزن مؤقت للشطف بتركيز 250 ملليمولار من المناعة. لذا لاحظ كيف يتغير لون الراتنج باتجاه اللون الأخضر. بسبب التركيزات العالية لبروتين CRE ، يتحول جزء OID في بعض الأحيان.

لمنع ذلك ، قم بخلط المحلول وإضافة مخزن مؤقت إضافي ليز ، يتم الآن تجميع جميع الكسور ونقلها لاحقا إلى أنبوب التحلل. سيؤدي التحلل إلى إزالة الخطوة الأولى لجهاز غسيل الكلى التي يتم إجراؤها مقابل المخزن المؤقت الذي يحتوي على تركيز عال من الملح. بعد ساعة واحدة ، يتم استبدال المحلول العالي بالملح ويتم تطبيق إجراء غسيل الكلى بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، يتم إخراج أنابيب غسيل الكلى من المخزن المؤقت عالي الملح ونقلها إلى مخزن مؤقت للجلسرين. بعد ثلاث إلى خمس ساعات ، يتم استبدال محلول الجلسرين ويتم إجراء غسيل الكلى مرة أخرى بين عشية وضحاها. سيؤدي التحلل ضد مخزن الجلسرين المؤقت إلى محلول مخزون مركز بثلاثة أضعاف على الأقل.

يمكن الآن تخزين محلول المخزون عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لعدة سنوات دون فقدان النشاط لضمان الجودة ، يمكنك تحميل عينات صفحة SDS التي تم جمعها على هلام وتلطيخها لاحقا. بالنسبة إلى Kamasi ، يمكن اكتشاف بروتين اندماج Cree كشريط بارز في جزء OID. من أجل استخدام التركيز المناسب لإعادة تركيب الطاقم ، يجب عليك تحديد التركيز عبر مقايسة ريدفورد.

كيفية تطبيق البروتينات الدائمة في خلايا الثدييات. بادئ ذي بدء ، قم بإعداد الخلايا المستهدفة من أجل تحقيق أعلى كفاءات في نقل البروتين. شاهد الخلايا أحادية الطبقة بكثافة تؤدي إلى طبقة خلية التقاء من 80 إلى 90٪ في اليوم التالي في حال كانت الخلايا المستهدفة هي نعم الخلايا ، والتي تزرع في مستعمرات مضغوطة.

افصل الخلايا وبشكل صوتي وشاهدها في معلق خلية واحدة قبل خمس ساعات. من المهم عمل تعليق خلية واحدة قبل نقل البروتين لأنه بخلاف ذلك يمكن نقل الخلايا الهوائية فقط على سطح المستعمرة. أطمح الوسائط وشاهد الخلايا الهوائية لفترة وجيزة باستخدام PPS قبل تجربة العلاج.

إزالة الوسائط المتبقية نعم ، الإجمالي التي تحتوي على مصل. بعد شفط PPS ، قم بتراكب الخلايا بالتنقيط واتركها تحتضن من ثلاث إلى خمس دقائق. تحقق الآن بالمجهر إذا كانت جميع المستعمرات تأتي مذابة في خلايا مفردة.

الأسباب المذكورة للتو ، هذه خطوة حاسمة لنقل البروتين إلى خلايا نعم. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب. ضع الأنبوب في طاولة ، وجهاز الطرد المركزي وقم بتدوير الخلايا لأسفل ، وشفط العامل الفائق وأعد تعليق الخلية.

P في وسط النمو يخفف الخلايا إلى رقم الخلية المناسب. هذا بالطبع يعتمد على حجم زراعة الأنسجة. طبق يحتضن الخلايا الهوائية لمدة خمس ساعات إضافية.

سيعطي هذا الخلايا الهوائية وقتا كافيا للالتصاق بالقاع والنمو اللاصق. يمكن تخزين مخزون الصفوف من ثلاث فئات عند 20 درجة تحت الصفر لأكثر من عامين. عند العمل مع بروتين الاندماج الدائم للخلية المؤتلفة ، من المفيد جدا أن يكون لديك مثل هذا الحل الذي يمكن استخدامه عند الطلب.

أثناء انتظار الخلايا لتلتصق بالطبق ، يمكن للمرء أن يحضر وسائط نقل C ببساطة تخفيف حجم مناسب من بروتين الزحف الدائم للخلية من مخزون الكوليسترول في نفسك. وسائط. نظرا لأن محلول مخزون كلير ليس معقما بعد ، يجب ترشيح الوسائط العابرة بشكل معقم قبل تطبيقها. نوصي باستخدام حقنة يمكن تثبيتها على مرشح ربط بروتين الفص.

تركيز الخور النهائي على نوع الخلية أو مكملات الوسائط. على سبيل المثال ، المصل له تأثير سلبي قوي على كفاءة التحويل. يمكن التغلب على ذلك باستخدام وسائط خالية من المصل أو عن طريق زيادة تركيز الخور.

نجد الحالة المثلى التي تتيح أعلى كفاءة لإعادة التركيب. تركيز مرسوم الهيدرات يبدأ من oh 0.5 إلى 10 ميكرومولار. نوصي باختبار أوقات حضانة مختلفة بين ست و 18 ساعة.

بعد خمس ساعات من الحضانة ، أخرج الخلايا المستهدفة واستنشق الوسائط المتقاطعة. بعد ذلك ، نستبدلها بوسائط نقل البروتين ، ونعيد الخلايا الهوائية إلى الحاضنة بعد الحضانة بين عشية وضحاها. غسل الخلايا D لفترة وجيزة باستخدام PPS وتغيير وسائط نقل البروتين إلى وسائط ES العادية.

بعد 48 ساعة من حضانة الخلية ، يمكن اكتشاف التعبير الجيني الدائم للخلية عن طريق xul. تم بنجاح تلطيخ الخلايا ذات النمط الظاهري الإيجابي للبيجا وراثيا عن طريق إعادة التركيب الخاص بالموقع. كري التقرير.

تستخدم الخلايا CRE بناء Lae عند إعادة التركيب الوسيط المسبق. يتم استئصال تسلسل توقف الجناح P للقفل ويتم تنشيط جين المراسل الفاخر مدفوعا بواسطة مروج الفريق. من أجل تقييم كفاءة إعادة التركيب في الخلايا الهوائية المراسلة المعالجة مسبقا ، يجب إصلاح الخلايا الهوائية.

تغسل وسائط الشفط الخلايا مرتين بخلايا تراكب PBS مع 4٪ PFA وتحتضن الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك غسل الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد شفط PBS من خطوة الغسيل الأخيرة في محلول Xal Stain إلى الآبار ، تحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة في حاضنة.

في اليوم التالي ، يمكن مراقبة نشاط بيل بواسطة الخلايا ذات الياقات الزرقاء. يمكن تحديد كفاءة إعادة التركيب من خلال عدد المستعمرات الزرقاء. في ظل الظروف المثلى ، يجب أن تكون قادرا على تحقيق كفاءة إعادة تركيب أعلى من 90٪ حسنا ، لقد أوضحنا لك اليوم كيفية التعبير عن إعادة تركيب الاستعلام الخاص بالموقع وتنقيتها من البريد القولوني.

في دراسة إثبات المبدأ هذه ، تمكنا من إحداث إعادة التركيب في معظم الأملاح. حسنا ، هذا كل شيء. حظا سعيدا مع تجاربك