النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

الهدف العام لهذه المنصة القائمة على الشريحة ذات البنية النانوية هو تحليل وظيفة البروتين الغشائي على المستوى الجزيئي الفردي بطريقة متوازية للغاية. من خلال قدرته على حل البروتينات المفردة ، يتم تحقيق رؤى جديدة حول نقل الأغشية وتدفقها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتين الغشائي ، مثل الموصلية أو سلوك النقل للقنوات المفردة أو الناقلات ، خاصة مع البضائع غير الكهربائية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التوازي العالي المستمد من تصميم رقاقة الهيكل النانوي ، والتي تتميز بمئات الآلاف من المسام النانوية وقراءة الفلورسنت من أحداث النقل. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى ما يخلق أفضل فحوصات للمكتبات الفعالة لبروتينات الغشاء. لأن النظام الأساسي القائم على الرقاقة يتيح تسجيل النقل المتوازي والآلي للغاية.

بشكل عام ، سيتعلم الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسرعة كيفية التعامل مع التقنية المقدمة. كان التركيز دائما على إنشاء اختبار سهل الاستخدام حتى يتمكن جميع المهتمين من اعتماده. يستخدم اختبار النقل الغشائي هذا السيليكون على الرقاقة المعزولة ، المصممة باستخدام نقش أيون التفاعل.

يتم تصنيع حوالي 1 ، 000 رقائق فحص من كل رقاقة. تحتوي كل شريحة على 250،000 تجاويف صغيرة. يتم إغلاق هذه التجاويف بواسطة طبقات ثنائية الدهون تحتوي على بروتينات النقل ذات الأهمية.

يشكل الغشاء واجهة المستشعر. في البداية ، يتم احتواء المواد الفلورية على جانب واحد من الطبقة الدهنية الثنائية ، بما يتوافق مع الجزء الداخلي من الجسيمات الشحمية التي تتكون منها. يمكن معالجة كل تجويف عبر قراءة مضان متعدد الأطياف.

تحجب الطبقة العليا غير الشفافة إشارات الفلورسنت من الخزان العازل ، مما يجعل الرقاقة الحيوية متوافقة مع المجاهر الفلورية المقلوبة. باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية ، تم قياس فتحات المسام المرتبة بالتساوي وخشونة سطح طبقة ثاني أكسيد السيليكون عند 3.6 نانومتر ، وهو الأمثل لاندماج الحويصلات. يظهر الفحص المجهري الإلكتروني المسح مقطعا عرضيا من خلال مسام نانوية ، والتي تصل إلى تجاويف الفيمتوليتر داخل شريحة السيليكون.

يوضح هذا الفيديو تحضير البروتينات ، وتحضير الرقائق للفحص ، وتنفيذ الفحص الأساسي. قم بتوصيل قارورة دائرية القاع مغسولة بالإيثانول بمبخر دوار. جفف الطبقة الدهنية لمدة 40 دقيقة عند 300 مللي بار ، ودرجة حرارة حمام مائي 30 درجة مئوية ، وسرعة دوران قصوى لتشكيل طبقة دهنية متجانسة على الجدار الزجاجي للقارورة.

بعد ذلك ، باستخدام مضخة عالية التفريغ ، جفف الطبقة الدهنية لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من العازلة وثمانية حبات زجاجية مغسولة بالإيثانول إلى القارورة لصنع الحويصلات متعددة الصفائح. قم بتوصيل القارورة بالمبخر الدوار وقم بتدويرها بدون فراغ عند 50 درجة مئوية بأقصى سرعة.

بعد 45 دقيقة ، سيظهر المحلول حليبي ، مع عدم وجود طبقة دهنية متبقية على الجدران. انقل القارورة تحت غاز خامل إلى حمام بالموجات فوق الصوتية ، وقم بصوتها لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. يعطل صوتنة الجسيمات الشحمية مما يجعلها أحادية الصفيحة.

الآن ، قم بتقسيم محلول LUV إلى مليلتر واحد ، وقم بإجراء خمس دورات ذوبان الجليد باستخدام النيتروجين السائل وحمام مائي 40 درجة مئوية. هذا يؤدي إلى تمزق الجسيمات الشحمية وإعادة ترتيبها ونموها. في خطوة التجميد الأخيرة ، قم بتخزين جميع العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قبل إعادة تكوين كمية LUV ، قم بثق الجسيمات الشحمية عن طريق تمرير الكمية من خلال غشاء مرشح بولي كربونات 400 نانومتر 17 مرة ، باستخدام آلة بثق صغيرة. بعد ذلك ، قم بزعزعة استقرار LUVs عن طريق إضافة 4٪ Triton X-100 مقابل 0.25٪ في المحلول. احتضن الخليط لمدة خمس دقائق عند 50 درجة مئوية.

الآن ، امزج جزءا واحدا من MscL المنقى والمعدل في 20 جزءا من الجسيمات الشحمية المشبعة بالمنظفات ، واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، خذ 100 ميكرولتر ، وأضف حجما واحدا من 30 مللي مولار من الكالسين. احتضن هذا الخليط لمدة خمس دقائق عند 50 درجة مئوية.

الآن ، قم بإزالة المنظف من العينة المعالجة بالكالسين وغير المعالجة. أضف الخرزات الحيوية المبللة في مخزن ثلاثي إلى كل منها ، واحتضنها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على صفيحة دوارة. قبل التجربة ، اختبر المستحضر باستخدام اختبار النشاط.

للبدء ، اخلطي قاعدة المطاط الصناعي في عامل المعالجة ، وجفف الخليط تماما حتى يصبح مذعورا. يجب استخدام المادة اللاصقة في غضون 30 دقيقة عندما تكون جاهزة. في هذه الأثناء ، مع اتخاذ الاحتياطات ، قم بتنظيف شريحة زجاجية للغطاء باستخدام خمسة ملليلتر من الكلوروفورم ، المطبقة من حقنة زجاجية ، واترك الشريحة تجف.

الآن ، باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر ، قم بإيداع المادة اللاصقة المحضرة على زجاج الغطاء. بعد ذلك ، قم بإزالة شريحة بعناية من لوح الويفر باستخدام ملاقط دقيقة. مع رفع الجانب المطلي من الرقاقة ، قم بإيداعه على المادة اللاصقة ، وافركه برفق في الشريحة لتوزيع المادة اللاصقة بالتساوي.

لا تدع فقاعات الهواء تحبس أدناه ، أو أي مادة لاصقة تتسرب إلى أعلى الشريحة. أيضا ، قم بعمل التجميع بحيث يتناسب مع حامل الشرائح المكون من ثماني غرف. الآن جفف التجميعات لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية في مجفف خزانة.

في وقت لاحق ، قم بإزالة الطبقة الواقية من الرقائق بقليل من غسلات المذيبات عند 54 درجة مئوية. ضع الرقائق المثبتة أولا في حامل الشرائح. ثم احتضنها في ثلاثة حمامات مذيبات لمدة 10 دقائق لكل منها.

الأيزوبروبانول والأسيتون والأيزوبروبانول. بعد ذلك ، اغسل الرقائق بعناية وبدقة بالماء النقي للغاية. أكمل العملية عن طريق تجفيف الرقائق تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.

الآن ، قم بإعداد شريحة لزجة من ثمانية آبار وضعها للخلف على المقعد. بعد ذلك ، ارفع شرائح الغطاء بعناية واضغط عليها على الشريحة اللاصقة مع مواجهة الرقائق للآبار. دع التجميع يرتاح لبضع دقائق قبل المتابعة.

قبل الشروع في مقايسة الإزاحة ، اغسل مجموعة الشريحة جيدا ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، مع الانتهاء من حمام عازلة Tris. بعد ذلك ، استبدل محلول الحمام بمحلول DOPEd Tris المؤقت ، الذي يحتوي على خمسة مللي مولر كلوريد الكالسيوم ، وصبغة ميكرومولار Oy647. بعد ذلك ، أضف البروتينات إلى حجرة الرقاقة للحصول على تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل مليلتر ، وانتظر ساعة واحدة.

بعد ساعة ، اشطف الرقائق أربع مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول Tris الخالي من الكالسيوم. الآن ، أضف الصبغة الخاضعة للرقابة إلى كل بئر إلى خمسة ميكرومولار ، واستمر في الفحص. بعد ذلك ، قم بتركيب حامل الشريحة على مجهر التألق ، وركز على حافة رقاقة المسام النانوية للعثور على التجاويف الدقيقة.

بمجرد التركيز على التجاويف الدقيقة ، امسح مصفوفة المسام النانوية بحثا عن منطقة تعرض أعلى نسبة سقف. وترد التفاصيل في بروتوكول النص. تم تحضير الجسيمات الشحمية وفحصها من حيث حجمها وتوزيعها وتشتتها.

كانت الجسيمات الشحمية المحضرة أكبر من قطر المسام للفحص ، وهو أمر ضروري. الجسيمات الشحمية أحادية التشتت مرغوبة أيضا. قبل التجربة ، تم فحص بروتين MscL المعدل في تحضير الجسيم الشحمي باستخدام مقايسة إزالة التألق.

كانت نسبة الجسيمات الشحمية التي تحتوي على MscL المعدل النشط كافية للمضي قدما في تجربة النقل. على الرقاقة الحيوية ، لوحظ انتقال مذاب لهدف الفلورسنت عبر قناة MscL المعدلة. تم استخدام المغير الكيميائي ، MTSET ، لفتح قنوات MscL المصممة هندسيا عبر التنافر الكهروستاتيكي.

تمت مراقبة الانخفاض اللاحق في التألق داخل مساحة التجويف. أثبتت هذه العملية أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة ، مع أحداث تدفق متسقة للغاية. تتجمع منحنيات التدفق الناتجة في مجموعتين متميزتين ، تتوافق مع أحداث نقل قناة واحدة أو متعددة القنوات.

كان النظام قادرا على متابعة ما يصل إلى ثلاث أصباغ فلورية فريدة من نوعها مع التحليل في الوقت الفعلي. هذا يسهل التمييز الدقيق للنتائج الإيجابية ، وأحداث التدفق الأسي الأحادي ، والحركية المعقدة ، والتدخلات الدهنية ، وتمزق الغشاء. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في خطوات متتالية ، وهي تحضير الشريحة ، وإعداد العينة ، والتصوير ، والتحليل ، مما يجعل البروتوكول بأكمله معياريا.