ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر باربرا ويندشيغل على مساعدتها في وضع إجراءات التشغيل القياسية. دينيس ريم لعمله على برنامج NanoCalcFX و Alina Kollmannsperger و Markus Braner و Milan Gerovac لاقتراحات مفيدة حول المخطوطة. دعم هذا العمل التعاون في المشروع الألماني الإسرائيلي (DIP) الذي قدمته DFG والوزارة الفيدرالية للتعليم والبحث إلى R.T. ، وكذلك الوزارة الفيدرالية للاقتصاد والتكنولوجيا (ZIM R&D PROJECT) إلى R.T. و Nanospot GmbH.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

تقنية المعروضة هنا يسمح للتحليل مواز للغاية من النقل بروتين الغشاء. ويمكن مباشرة أنظمة بروتين الغشاء أعيد تطبيقها على بيوشيب، مما يجعل التكيف من الناحية النظرية كل نقل غشاء أو توجيه ممكن. تحليل النقل يقتصر فقط عن طريق إنشاء نظام تلا الفلورسنت، إما عن طريق تغيير مباشر مضان (النبات من fluorophores أو ركائز fluorescently المسمى) أو التغيير غير المباشرة مضان (الأصباغ الحساسة للدرجة الحموضة، والتفاعلات الأنزيمية الثانوية). هذا الأخير، ولكن لم يتم بعد تأسيسها. <p class="jove_content...

أصبح تحليل بروتينات الغشاء من الاهتمام المتزايد للبحوث الأساسية والأدوية في السنوات ال 20 الماضية. تطوير عقاقير جديدة تعتمد على تحديد وتوصيف مفصل للأهداف جديدة، ويجري حاليا واحدة من العوامل التي تحد. حقيقة أن حوالي 60٪ من جميع الأهداف المخدرات هي بروتينات غشاء 1، يجعل من تطوير تقنيات لتوضيح وظيفتها الأهم. في الماضي، وقد تم تطوير تقنيات لدراسة قنوات كهربي والنقل في العديد 2-4. ركائز غير كهربي في العكس تمثل مهمة أكثر صعوبة. ومع ذلك فهي تحظى باهتمام خاص كأهداف المخدرات الرئيسية، كما أنها تتحكم في تدفق المواد المذابة والمواد الغذائية عبر غشاء الخلية ووظيفتها باسم المستقبلات الرئيسية في الإشارة شلالات 5. وقد بذلت جهود كبيرة في تطوير رechniques لدراسة وظيفة البروتينات النقل غشاء 6 و 7. ظهرت النظم التي تستخدم الأغشية الصلبة المدعومة من الأدوات كما الواعدة في هذا المجال 8-10، بما في صلب طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، طبقات ثنائية المربوطة 11، 12، الأغشية microblack الدهون 13 و 14 و الأم صفائف حويصلة 15 و 16 على سبيل المثال لا الحصر. تتوفر حتى مع الاجهزة التجارية 17، 18 بعضهم. وقد نشرت بعض الأمثلة التي تجمع بين القدرة على دراسة بروتينات الغشاء واحدة بطريقة موازية للغاية 14، 19، وهو شرط أساسي لتطبيقات الفحص. ومع ذلك، هذه الأساليب نادرا ما يسد من البحوث الأساسية إلى البيئة الصناعية. كثيرا ما تكمن الصعوبات في قدرة النظام أن يكون automatable، والإنتاج الكثيف من حيث التكلفة و / أو التحضير شاقة. نهج س vercoming جميع العقبات المذكورة أعلاه هو الهدف النهائي. وقد تم تطوير تقنية المعروضة هنا لدراسة قنوات الغشاء والنقل في المختبر في بيئة تسيطر عليها على مستوى البروتين واحدة 20-22. وأكثر من ذلك بكثير إنشاء إعادة تشكيل بروتينات الغشاء النقاء في LUVs من نهج مماثلة لGUVs 23-26 أو الدهون السوداء الأغشية 27. يمكنهم مباشرة يتم تطبيقها على سطح رقاقة، حيث تشكيل طبقة ثنائية تجري من خلال عملية التجميع الذاتي. تصميم الزجاج السفلي من رقاقة nanoporous (الشكل 1) يسمح للفحص المجهري الهواء، مما يسمح للأتمتة واضحة للنظام. جنبا إلى جنب مع مرحلة الآلية يمكن قياس رقائق متعددة في نفس الوقت، مع كل مجال الرؤية التي تحتوي على الآلاف من تجاويف مختومة لتحليلها. = "1"&gt; <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig1.jpg"> الشكل 1. تصميم biochips ثقب النانو المضاعفة. أ) السيليكون على العازل (منظم أبناء العراق) رقاقة عن طريق النقش على رد الفعل ايون. هي ملفقة حوالي 1150 رقائق الفردية من كل رقاقة مع خصائص مماثلة والجودة. ب) ويضم كل رقاقة 250،000 microcavities الفردية مع فتحات نانو. شريط مقياس: 200 ميكرون C) كل تجويف هو عنونة عبر مضان متعددة الأطياف للقراءة خارج. وintransparent أعلى كتل طبقة الاشارات الفلورسنت من الخزان العازلة، مما يجعل بيوشيب متوافقة مع المجاهر مضان مقلوب. D) مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير يكشف ترتيب بالتساوي فتحات المسام وخشونة سطح طبقة ثاني أكسيد السيليكون من 3.6 نانومتر (ن = 40) الأمثل لالانصهار الحويصلة. مقياس شريط: 5 ميكرون E) هيئة التصنيع العسكري الضوئي الإلكترونمعارض roscopy (SEM) صورة مقطع عرضي من خلال ثقب النانو مما يتيح الوصول إلى تجاويف فيمتولتر داخل رقاقة السيليكون. تم إعادة استخدام هذا الرقم بإذن من 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> يتم تنفيذ جميع تحليل البيانات باستخدام مجانية لضمان الوصول غير المقيد للمستخدمين النهائيين. ويتم تحليل السلاسل الزمنية باستخدام برنامج معالجة الصور والعرف بناء منحنى برامج التحليل تمكين تجهيز دفعة والارتباط المباشر لمجموعات كبيرة من البيانات مع قنوات الفلورسنت متعددة وآلاف من المنحنيات. البروتين النموذج المستخدم في هذا البروتوكول هو قناة mechanosensitive من البروتين قناة (MscL) تصرف كبير المستمدة من E. القولونية. وهي بمثابة صمام للافراج عن صدمة التناضحي في الطبيعة، ولكن تم تعديلها في مثل هذه الطريقة التي صممت بعقلانية syntيمكن أن تساهمي ظائف hetic أن تعلق على جانب قنوات انقباض. عبر المسؤول عن النفور من المنشط ملزمة تساهميا (MTSET) يتم تشغيل القناة لفتح، وخلق نانو صمام. جزيئات صغيرة مثل أيونات، المياه، بروتينات صغيرة، ولكن أيضا fluorophores صغيرة يمكن أن تتخلل من خلال القناة. هنا، يتم استخدام البروتين كنموذج للتدليل على قدرة نظام للكشف عن النبات بوساطة البروتين.

<table><tbody><tr><td><قوي >كاشف < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>[2- (ثلاثي ميثيل أمونيوم) إيثيل] ميثانيثيوسلفونات</td><td>شركة تورونتو للأبحاث للكيماويات</td><td>T792900</td><td>MTSET ؛ مائية بالماء. يحفظ كبودرة جافة عند -80 درجة مئوية. يستخدم مباشرة (30 دقيقة) بعد الذوبان في المخزن المؤقت.</td></tr><tr><td>1 مل حقنة محكمة الغلق للغاز</td><td>هاميلتون</td> <td># 1001</td><td></td></tr><tr><td>10 مل قارورة مستديرة</td><td>شوت دوران</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.7 ملم خرز زجاجي</td><td>روث</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-بروبانول</td><td>روث</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 سم أنبوب تمديد لور لوك</td><td>سارستيدت</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>الأسيتون</td><td>روث</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>بيو بيودس SM-2 يجب تنشيط الممتزات</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>قبل الاستخدام الأول</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>تخزين داكن عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>كاشف الكلوروفورم الصف</td><td>VWR المواد الكيميائية</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>تخزين الظلام عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>الإيثانول المطلق</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt حقنة ذات استخدام واحد</td><td>براون</td><td>460 60 51 فولت</td><td></td></tr><tr><td>حقنة Injekt-F أحادية الاستخدام</td><td>براون</td><td>91 66 017 فولت</td><td></td></tr><tr><td>مقاطع كيك</td><td>شوت</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L- & alpha ؛ فوسفاتيديل كولين ، 20٪ (فول الصويا)</td> <td>أفانتي القطبية</td><td>5416016</td><td>تخزين الدهون تحت غاز خامل عند -20 درجة ؛ ج</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم 99.5٪ سنويا</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>رقاقة / رقائق Nanopore E100</td><td>Micromotive (ماينز / ألمانيا)</td><td></td> <td>متوفرة عند الطلب</td></tr><tr><td>غشاء Nucleopore Track-Etch 0.4 & micro ؛ م</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextern 488 (70 kDa)</td> <td>متجر Life Technologies</td><td>D-7173</td><td>مظلم عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M & uuml ؛ nster / ألمانيا)</td> <td>OY-647-T-1mg</td><td>تخزين الظلام عند -20 درجة ؛ ترشيح حقنة</td></tr><tr><td>Rotilabo C ، غير معقم ، حجم المسام 0.22 ومايكرو ؛ م</td><td>روث</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>مادة العمود لحجم استبعاد الكروماتوغرافيا</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>عامل معالجة داو كورنينج</td><td></td><td>لتثبيت الرقاقة على غطاء زجاجي دعم</td></tr><tr><td>لزج الشريحة 8 جيدا</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>غرفة متعددة الآبار للتركيب على الشرائح الزجاجية (حامل رقاقة)</td></tr><tr><td>محبس ثلاثي الاتجاهات أزرق</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9٪ Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 & micro ؛ م مرشح غشاء نترات السليلوز</td><td>روث</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; تشي 461 حمام مائي</td><td>ب &uuml; تشي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ب & uuml; تشي روتابخار RE 111</td><td>B&uuml; مقياس</td> الطيف الفلوري تشي <td></td><td></td></tr><tr><td>كاري كسوف &nbsp;</td>مضخة غشاء <td>أفيستين</td> الطارد الصغير فاريان <td></td><td></td></tr><tr><td>ليبوسوفاست</td><td></td>&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight نانو الجسيمات تتبع المجهر</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE مجهر</td><td>Synentec</td><td></td><td>متاح عند الطلب</td></tr><tr><td>التحكم في المضخة</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator حمام Sonorex RK100H</td><td>Brandelin الإلكتروني</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>مضخة فراغ RC5</td><td>حمام مائي Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>منظف البلازما PDC-37G</td><td>هاريك بلازما</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>مفتوح المصدر</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>برنامج معالجة الصور العلمي</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>مجاني</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td> <td>برنامج تحليل / تقييم البيانات لمجموعات البيانات الحركية للنقل الضخم</td></tr><tr><td>NTA 2.3 البرامج التحليلية</td><td>برنامج</td><td></td><td>الحصول على البيانات وتحليلها لتتبع الجسيمات النانوية المجهر</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperature Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>برنامج التحكم في درجة الحرارة لمجهر تتبع الجسيمات النانوية</td></tr></tbody></table>

النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

نقل البروتين غشاء على مستوى بروتين واحد لا يزال يتهرب تحليل مفصل، إذا الركيزة translocated غير قابلة للكهربي. وقد بذلت جهود كبيرة في هذا المجال، ولكن تقنيات تمكين تحليل النقل عالية الإنتاجية الآلي في تركيبة مع تقنيات طبقة ثنائية المادة الدهنية الخالية من المذيبات المطلوبة للتحليل النقل غشاء نادرة. هذا النوع من النقل ولكن هو الحاسم في توازن الخلايا وبالتالي هدفا رئيسيا في تطوير العقاقير ومنهجيات للحصول على أفكار جديدة بحاجة ماسة. يصف المخطوطة هنا قدمت إنشاء والتعامل معها من بيوشيب رواية لتحليل البروتين بوساطة عمليات النقل غشاء على قرار نقل احد. يتكون بيوشيب من microcavities محاطة nanopores التي هي موازية للغاية في التصميم ويمكن أن تنتج في الصف الصناعي وكمية. ويمكن مباشرة الجسيمات الشحمية البروتين إيواء تطبيقها علىسطح رقاقة تشكيل طبقات ثنائية للدهون، والتي تمتد المسام الذاتي تجميعها باستخدام SSM-تقنيات (بدعم الصلبة الأغشية الدهنية). المسام التي تغطي أجزاء من الغشاء وقائما بذاته، وتوفير واجهة للالنبات الركيزة داخل أو خارج الفضاء تجويف، والتي يمكن أن تتبعها قراءات الفلورسنت متعددة الأطياف في الوقت الحقيقي. وضع إجراءات التشغيل القياسية (الأورام) يسمح بإنشاء واضحة من طبقات ثنائية الدهون-إيواء البروتين على سطح رقاقة من تقريبا كل بروتين الغشاء الذي يمكن تشكيلها وظيفيا. الشرط الوحيد هو إنشاء نظام تلا الفلورسنت لركائز النقل غير كهربي. تطبيقات فحص عالية المحتوى هي محقق عن طريق استخدام آلية المجهر الفلورسنت المقلوب تسجيل رقائق متعددة في نفس الوقت. ويمكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة باستخدام متاحة بحرية برامج التحليل مصمم خصيصا. ثلاثة ألوان متعددة الطيفية الفلوريةقراءة من علاوة على ذلك يسمح للتمييز البيانات غير منحازة إلى فئات الأحداث المختلفة، والقضاء على نتائج إيجابية كاذبة. وتعتمد هذه التقنية رقاقة حاليا على شافي 2 السطوح، ولكن المزيد من functionalization باستخدام أسطح رقاقة الذهب المطلي ممكن أيضا.

يمكن بسهولة الأغشية التي تغطي المسام المراد إنشاؤها على سطح رقاقة ذات البنية النانومترية بطريقة الذاتي تجميعها. لكن العملية الأساسية لا تزال حساسة وتتأثر العديد من المعلمات مثل حجم الجسيمات الشحمية، monodispersity من السكان الحويصلية، lamellarity، lipid- والملح التركيز وسطح الكيميائية الخصائص. وقد اتسمت معظم هذه المعايير بدقة وموحدة في البروتوكول أعلاه. غيرها من المعالم ولكن يجب أن يتم التحقق خلال كل إعداد جديد، لضمان تجربة ناجحة. هذه هي توزيع حجم ...

يصف البروتوكول المقدم تحليل النقل بوساطة البروتين الغشائي على مستوى الناقل الفردي باستخدام طبقات ثنائية دهنية خالية من المذيبات الممتدة عبر المسام. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء رقائق مصفوفة نانوية منتجة بكميات كبيرة ، جنبا إلى جنب مع الحصول على البيانات وتحليلها متوازية للغاية ، مما يتيح الإنشاء المستقبلي لفحوصات مستجيب البروتين الغشائي

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

الهدف العام لهذه المنصة القائمة على الشريحة ذات البنية النانوية هو تحليل وظيفة البروتين الغشائي على المستوى الجزيئي الفردي بطريقة متوازية للغاية. من خلال قدرته على حل البروتينات المفردة ، يتم تحقيق رؤى جديدة حول نقل الأغشية وتدفقها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتين الغشائي ، مثل الموصلية أو سلوك النقل للقنوات المفردة أو الناقلات ، خاصة مع البضائع غير الكهربائية.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التوازي العالي المستمد من تصميم رقاقة الهيكل النانوي ، والتي تتميز بمئات الآلاف من المسام النانوية وقراءة الفلورسنت من أحداث النقل. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى ما يخلق أفضل فحوصات للمكتبات الفعالة لبروتينات الغشاء. لأن النظام الأساسي القائم على الرقاقة يتيح تسجيل النقل المتوازي والآلي للغاية.بشكل عام ، سيتعلم الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسرعة كيفية التعامل مع التقنية المقدمة. كان التركيز دائما على إنشاء اختبار سهل الاستخدام حتى يتمكن جميع المهتمين من اعتماده. يستخدم اختبار النقل الغشائي هذا السيليكون على الرقاقة المعزولة ، المصممة باستخدام نقش أيون التفاعل.يتم تصنيع حوالي 1 ، 000 رقائق فحص من كل رقاقة. تحتوي كل شريحة على 250،000 تجاويف صغيرة. يتم إغلاق هذه التجاويف بواسطة طبقات ثنائية الدهون تحتوي على بروتينات النقل ذات الأهمية.يشكل الغشاء واجهة المستشعر. في البداية ، يتم احتواء المواد الفلورية على جانب واحد من الطبقة الدهنية الثنائية ، بما يتوافق مع الجزء الداخلي من الجسيمات الشحمية التي تتكون منها. يمكن معالجة كل تجويف عبر قراءة مضان متعدد الأطياف.تحجب الطبقة العليا غير الشفافة إشارات الفلورسنت من الخزان العازل ، مما يجعل الرقاقة الحيوية متوافقة مع المجاهر الفلورية المقلوبة. باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية ، تم قياس فتحات المسام المرتبة بالتساوي وخشونة سطح طبقة ثاني أكسيد السيليكون عند 3.6 نانومتر ، وهو الأمثل لاندماج الحويصلات. يظهر الفحص المجهري الإلكتروني المسح مقطعا عرضيا من خلال مسام نانوية ، والتي تصل إلى تجاويف الفيمتوليتر داخل شريحة السيليكون.يوضح هذا الفيديو تحضير البروتينات ، وتحضير الرقائق للفحص ، وتنفيذ الفحص الأساسي. قم بتوصيل قارورة دائرية القاع مغسولة بالإيثانول بمبخر دوار. جفف الطبقة الدهنية لمدة 40 دقيقة عند 300 مللي بار ، ودرجة حرارة حمام مائي 30 درجة مئوية ، وسرعة دوران قصوى لتشكيل طبقة دهنية متجانسة على الجدار الزجاجي للقارورة.بعد ذلك ، باستخدام مضخة عالية التفريغ ، جفف الطبقة الدهنية لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من العازلة وثمانية حبات زجاجية مغسولة بالإيثانول إلى القارورة لصنع الحويصلات متعددة الصفائح. قم بتوصيل القارورة بالمبخر الدوار وقم بتدويرها بدون فراغ عند 50 درجة مئوية بأقصى سرعة.بعد 45 دقيقة ، سيظهر المحلول حليبي ، مع عدم وجود طبقة دهنية متبقية على الجدران. انقل القارورة تحت غاز خامل إلى حمام بالموجات فوق الصوتية ، وقم بصوتها لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. يعطل صوتنة الجسيمات الشحمية مما يجعلها أحادية الصفيحة.الآن ، قم بتقسيم محلول LUV إلى مليلتر واحد ، وقم بإجراء خمس دورات ذوبان الجليد باستخدام النيتروجين السائل وحمام مائي 40 درجة مئوية. هذا يؤدي إلى تمزق الجسيمات الشحمية وإعادة ترتيبها ونموها. في خطوة التجميد الأخيرة ، قم بتخزين جميع العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.قبل إعادة تكوين كمية LUV ، قم بثق الجسيمات الشحمية عن طريق تمرير الكمية من خلال غشاء مرشح بولي كربونات 400 نانومتر 17 مرة ، باستخدام آلة بثق صغيرة. بعد ذلك ، قم بزعزعة استقرار LUVs عن طريق إضافة 4٪ Triton X-100 مقابل 0.25٪ في المحلول. احتضن الخليط لمدة خمس دقائق عند 50 درجة مئوية.الآن ، امزج جزءا واحدا من MscL المنقى والمعدل في 20 جزءا من الجسيمات الشحمية المشبعة بالمنظفات ، واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، خذ 100 ميكرولتر ، وأضف حجما واحدا من 30 مللي مولار من الكالسين. احتضن هذا الخليط لمدة خمس دقائق عند 50 درجة مئوية.الآن ، قم بإزالة المنظف من العينة المعالجة بالكالسين وغير المعالجة. أضف الخرزات الحيوية المبللة في مخزن ثلاثي إلى كل منها ، واحتضنها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على صفيحة دوارة. قبل التجربة ، اختبر المستحضر باستخدام اختبار النشاط.للبدء ، اخلطي قاعدة المطاط الصناعي في عامل المعالجة ، وجفف الخليط تماما حتى يصبح مذعورا. يجب استخدام المادة اللاصقة في غضون 30 دقيقة عندما تكون جاهزة. في هذه الأثناء ، مع اتخاذ الاحتياطات ، قم بتنظيف شريحة زجاجية للغطاء باستخدام خمسة ملليلتر من الكلوروفورم ، المطبقة من حقنة زجاجية ، واترك الشريحة تجف.الآن ، باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر ، قم بإيداع المادة اللاصقة المحضرة على زجاج الغطاء. بعد ذلك ، قم بإزالة شريحة بعناية من لوح الويفر باستخدام ملاقط دقيقة. مع رفع الجانب المطلي من الرقاقة ، قم بإيداعه على المادة اللاصقة ، وافركه برفق في الشريحة لتوزيع المادة اللاصقة بالتساوي.لا تدع فقاعات الهواء تحبس أدناه ، أو أي مادة لاصقة تتسرب إلى أعلى الشريحة. أيضا ، قم بعمل التجميع بحيث يتناسب مع حامل الشرائح المكون من ثماني غرف. الآن جفف التجميعات لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية في مجفف خزانة.في وقت لاحق ، قم بإزالة الطبقة الواقية من الرقائق بقليل من غسلات المذيبات عند 54 درجة مئوية. ضع الرقائق المثبتة أولا في حامل الشرائح. ثم احتضنها في ثلاثة حمامات مذيبات لمدة 10 دقائق لكل منها.الأيزوبروبانول والأسيتون والأيزوبروبانول. بعد ذلك ، اغسل الرقائق بعناية وبدقة بالماء النقي للغاية. أكمل العملية عن طريق تجفيف الرقائق تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.الآن ، قم بإعداد شريحة لزجة من ثمانية آبار وضعها للخلف على المقعد. بعد ذلك ، ارفع شرائح الغطاء بعناية واضغط عليها على الشريحة اللاصقة مع مواجهة الرقائق للآبار. دع التجميع يرتاح لبضع دقائق قبل المتابعة.قبل الشروع في مقايسة الإزاحة ، اغسل مجموعة الشريحة جيدا ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، مع الانتهاء من حمام عازلة Tris. بعد ذلك ، استبدل محلول الحمام بمحلول DOPEd Tris المؤقت ، الذي يحتوي على خمسة مللي مولر كلوريد الكالسيوم ، وصبغة ميكرومولار Oy647. بعد ذلك ، أضف البروتينات إلى حجرة الرقاقة للحصول على تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل مليلتر ، وانتظر ساعة واحدة.بعد ساعة ، اشطف الرقائق أربع مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول Tris الخالي من الكالسيوم. الآن ، أضف الصبغة الخاضعة للرقابة إلى كل بئر إلى خمسة ميكرومولار ، واستمر في الفحص. بعد ذلك ، قم بتركيب حامل الشريحة على مجهر التألق ، وركز على حافة رقاقة المسام النانوية للعثور على التجاويف الدقيقة.بمجرد التركيز على التجاويف الدقيقة ، امسح مصفوفة المسام النانوية بحثا عن منطقة تعرض أعلى نسبة سقف. وترد التفاصيل في بروتوكول النص. تم تحضير الجسيمات الشحمية وفحصها من حيث حجمها وتوزيعها وتشتتها.كانت الجسيمات الشحمية المحضرة أكبر من قطر المسام للفحص ، وهو أمر ضروري. الجسيمات الشحمية أحادية التشتت مرغوبة أيضا. قبل التجربة ، تم فحص بروتين MscL المعدل في تحضير الجسيم الشحمي باستخدام مقايسة إزالة التألق.كانت نسبة الجسيمات الشحمية التي تحتوي على MscL المعدل النشط كافية للمضي قدما في تجربة النقل. على الرقاقة الحيوية ، لوحظ انتقال مذاب لهدف الفلورسنت عبر قناة MscL المعدلة. تم استخدام المغير الكيميائي ، MTSET ، لفتح قنوات MscL المصممة هندسيا عبر التنافر الكهروستاتيكي.تمت مراقبة الانخفاض اللاحق في التألق داخل مساحة التجويف. أثبتت هذه العملية أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة ، مع أحداث تدفق متسقة للغاية. تتجمع منحنيات التدفق الناتجة في مجموعتين متميزتين ، تتوافق مع أحداث نقل قناة واحدة أو متعددة القنوات.كان النظام قادرا على متابعة ما يصل إلى ثلاث أصباغ فلورية فريدة من نوعها مع التحليل في الوقت الفعلي. هذا يسهل التمييز الدقيق للنتائج الإيجابية ، وأحداث التدفق الأسي الأحادي ، والحركية المعقدة ، والتدخلات الدهنية ، وتمزق الغشاء. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في خطوات متتالية ، وهي تحضير الشريحة ، وإعداد العينة ، والتصوير ، والتحليل ، مما يجعل البروتوكول بأكمله معياريا.

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

approch قدم واحدة جزيء المجهري رؤى الرواية إلى النقل النووي.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

ووصف طريقة استخدام الحالة الصلبة nanopores لرصد الامتزاز غير محدد من البروتينات على سطح غير العضوية. الأسلوب يعمل على مبدأ مقاوم النبض ، مما يسمح للامتزاز أن يكون بحث في الوقت الحقيقي وعلى مستوى واحد جزيء. لأن عملية امتصاص البروتين وحيد هو أبعد ما يكون عن التوازن ، نقترح العمل صفائف متوازي من nanopores الاصطناعية ، وتمكين لتحديد كمي لمعدل أول رد فعل واضح ترتيب ثابت الامتزاز البروتين وكذلك وانجميور ثابت الامتزاز.

رصد بروتين الامتزاز مع الحالة الصلبة Nanopores

يتم تقديم منهجية لإعداد ثقوب النانو الحالة الصلبة في حل للتجارب إزفاء الجزيئية البيولوجية. من خلال تطبيق نبضات قصيرة من الحقول الكهربائية عالية، وقطرها ثقب النانو يمكن تكبير controllably بدقة subnanometer وخصائص الضوضاء الكهربائية قد تحسن بشكل ملحوظ. يتم تنفيذ هذا الإجراء في الموقع باستخدام المعدات المختبرية القياسية تحت ظروف تجريبية.

صقل الحجم والتقليل من الضوضاء من الحالة الصلبة ثقوب النانو

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموعات الأكسجين المعدنية المنفصلة، polyoxometalates (POMs)، عند حد جزيء واحد باستخدام منصة إلكترونية البيولوجية المستندة إلى nanopore. وتوفر هذه الطريقة نهجا ً تكميلياً لأدوات الكيمياء التحليلية التقليدية المستخدمة في دراسة هذه الجزيئات.

التوصيف الفيزيائي عالي الاستبانة للجسيمات النانوية المعدنية المفردة

هنا، نحن نقدم بروتوكولا لدراسة الآلية الجزيئية لبروتون إزفاء عبر الأغشية الدهنية الدهنية واحد، استخدام الفسفرة بو3  كمثال. يمكن الكشف عن الجمع بين كهربية والفحص المجهري الأسفار، تغييرات درجة الحموضة في التجويف حويصلات وحيد، والتي تحتوي على واحد أو إنزيم متعددة، وتحليلها على حدة.

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

نانو التسلسل هو تقنيه جديده تسمح بالتسلسل الفعال من حيث التكلفة في المواقع النائية والبيئات التي تفتقر إلى الموارد. هنا ، نقدم بروتوكولا لتسلسل mRNAs من الدم الكامل الذي يتوافق مع مثل هذه الظروف.

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

هنا هو بروتوكول لتحديد الدولة القلة من البروتينات الغشاء الذي يستخدم نظام غشاء الخلايا الأصلية نانو جسيمات بالاقتران مع المجهر الإلكتروني.

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين بالمستقبلات في الوقت الفعلي في بيئة خلوية. يتم قياس الارتباط على أنه نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين مشتقات نيوكليوتيدات ثلاثي نيتروفينيل والبروتين المسمى بحمض أميني فلوري غير قانوني.

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

يصف هذا البروتوكول نهج معالجة الصور القائم على iSCAT وتتبع الجسيمات المفردة الذي يتيح التحقيق المتزامن للكتلة الجزيئية والسلوك المنتشر للجزيئات الكبيرة التي تتفاعل مع الأغشية الدهنية. يتم توفير إرشادات خطوة بخطوة لإعداد العينات، والتحويل من الكتلة إلى التباين، والحصول على الأفلام، وما بعد المعالجة جنبا إلى جنب مع الاتجاهات لمنع المزالق المحتملة.

تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة لتوصيف ديناميكيات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام مجهر TIRF لتتبع القنوات الأيونية الفردية وتحديد نشاطها في الأغشية الدهنية المدعومة ، وبالتالي تحديد التفاعل بين حركة الغشاء الجانبي ووظيفة القناة. يصف كيفية تحضير الأغشية وتسجيل البيانات وتحليل النتائج.

تصوير أحادي الجزيء للحركة الجانبية ونشاط القناة الأيونية في طبقات الدهون المزدوجة باستخدام المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)

اكتشف تحليل وظائف البروتينات الغشائية على المستوى الجزيئي الفردي باستخدام رقائق مصفوفة ثقوب النانو عالية التوازي. تتيح هذه التقنية قراءة فلورية لأحداث النقل وتوفر رؤى جديدة حول ديناميكيات النقل الغشائي.