عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر

هجرة الخلايا الليمفاوية التائية أثناء توجيه الأعضاء اللمفاوية ، والخروج من الأوعية الدموية والدخول إلى الأنسجة المحيطية. تتضمن هذه العملية التفاعل اللاصق لسطح الخلية التائية مع الخلايا الأخرى. لفحص هذه الظاهرة في المختبر ، يتم عزل الخلايا الليمفاوية التائية البشرية وزراعتها ووضعها على ألواح زراعة الأنسجة المغلفة بالبروتين اللاصق.

[إيكم] واحدة و [سكدف] [سك] [كيموكين] واحدة. يمكن بعد ذلك الحصول على صور هجرة الخلايا الليمفاوية التائية وتحليلها. مرحبا ، أنا كريج ليفورت ومختبر مينسو كيم في مركز بيولوجيا اللقاحات والمناعة في جامعة روتشستر.

سنعرض لك اليوم إجراء لعزل واستزراع الخلايا الليمفاوية البشرية المراهقة ، وهو تحليل لهجرتها في المختبر. نستخدم هذا الاختبار في مختبرنا لدراسة دور الإنتجرينات وهجرة الخلايا التائية. الإنتجرين الرئيسي في الخلية التائية هو المستضد المرتبط بوظيفة الخلايا الليمفاوية الأول أو LFA واحد.

الروابط المحددة ل LFA واحد هي icas ، مثل ICAM واحد. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى إشارة قريبة لهجرة الخلايا التائية لتوفير إشارة اتجاهية وكذلك لتنشيط الإنتجرين. في فحصنا ، نستخدم ICAM البشري و CX CL 12 أو SDF واحد كركائز لهجرة الخلايا التائية.

لذلك دعونا نبدأ. بعد الحصول على دم بشري من متبرع سليم ، اترك الدم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. يستغرق هذا حوالي 30 دقيقة.

بمجرد أن يبرد الدم ، قم بإخراج الماصة برفق ثلاثة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ، ووسائط التدرج بكثافة متعددة الأشكال في أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة ثمانية ملليلتر. ثم أضف برفق ثلاثة ملليلتر من الدم الكامل في الأعلى. من المهم تجنب أي خلط.

ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها 500 جم لمدة 45 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، تم فصل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة أو P BMCs عن مكونات الدم الأخرى. تظهر طبقة PBMC كأول نطاق غائم من الأعلى.

في ظل ظروف معقمة ، قم بإزالة المرحلة العليا ذات اللون الأصفر الشفاف والتخلص منها بعناية. ثم استخدم ماصة صغيرة P 1000 لنقل طبقة PBMC إلى أنبوب مخروطي جديد. اغسل PBMC مرتين بخلايا الطرد المركزي PBS عند 500 جم لمدة خمس دقائق.

في كل مرة ، سيكون المادة الطافية غائمة إلى حد ما بعد كل غسلة. أعد تعليق الخلايا في 20 مل من وسائط RPMI 1640 التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين وميكروغرام واحد لكل مليلتر. يحفز Phyto hemagglutinin أو حضانة PHA في وجود PHA تنشيط الخلايا الليمفاوية التائية وتوسعها.

باستخدام ماصة ، انقل pbmc إلى قارورة ثقافة T 75. بعد ذلك ، تم تحضين 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى 24 ساعة. تسمح هذه الخطوة بفصل الخلايا الوحيدة ، التي ستلتصق بسطح القارورة عن الخلايا الليمفاوية التي تظل معلقة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة جميع الوسائط التي تحتوي بشكل أساسي على الخلايا الليمفاوية بعناية ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق. كان ريس هو حبيبات الخلية في RPMI 1640 ونقل الخلايا إلى T 75 flaz جديد يحتوي على 25 مل من RPMI 1640 مع FBS والبنسلين والستربتومايسين و PHA المحتضنة 37 درجة مئوية.

بعد 24 ساعة من النمو ، قد يكون من الضروري إضافة 15 إلى 20 مل من الوسائط الجديدة ونقلها إلى قارورة أكبر T 1 75. استمر في الحضانة لمدة ثلاثة أيام أو يومين. إذا كانت الحضانة الأولية ل PBMC بين عشية وضحاها بعد ثلاثة أيام ، فاستخدم ماصة لإزالة الوسط ، الذي سيحتوي على الخلايا الليمفاوية العالقة ونقله إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي مخروطي سعة 50 مليلتر عند 500 جم لمدة خمس دقائق.

كان ريس هو حبيبات الخلية ونقل الخلايا إلى T 75 جديد يحتوي على 25 مل من RPMI 1640. مع FBS ، البنسلين ، الستربتومايسين و IL البشري اثنين أو IL 15 ، ضع الخلايا في الحاضنة. في حالة بدء قارورة T 75 ، ستحتاج الثقافة إلى التوسع ونقلها إلى قارورة T 1 75.

بعد يوم إلى يومين تنمو الخلايا الليمفاوية لمدة أربعة إلى سبعة أيام. قبل يوم واحد من اختبار الهجرة ، قم بتغطية طبق زجاجي قاع 0.17 ملم يحتوي على 20 ميكروغراما لكل ملليلتر من البروتين A أو G في PBS ، واحتضان طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. اغسل الطبق على نطاق واسع باستخدام PBS ، ثم أضف ICAM one FC و SD F1 البشري في محلول PBS إلى الطبق.

احتضن لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة لشل حركة الجزيئات. حدد كثافة الخلايا المستنبتة باستخدام مقياس الخلوي الدموي. ثم اغسل الخلايا الليمفاوية مرتين باستخدام PBS وأعد تعليقها في مليلتر واحد من L 15 وسائط تحتوي على D جلوكوز بعد الحضانة ، وغسل الطبق المطلي ب ICAM واحد FC و SDF واحد على نطاق واسع باستخدام PBS ، ونقل الخلايا الليمفاوية التائية في مليلتر واحد من الوسائط إلى الطبق ، يجب استخدام ما يقرب من اثنين إلى خمسة مرات 10 إلى الخلية الخامسة لكل طبق لتحقيق كثافة خلية مناسبة لتحليل الهجرة.

للحصول على صور لهجرة الخلايا ، ضع الطبق على مرحلة المجهر في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها مثل غرفة ساخنة عند 37 درجة مئوية. افتح برنامج عناصر NIS في قائمة إعدادات الصورة. اختر اثنين في اثنين كوضع لكل من التصوير المباشر والتقاط الصور.

انتقل إلى قائمة التطبيقات واختر وحدد وتشغيل وتجربة. اختر المدة الزمنية بين الصور والوقت الإجمالي. لتسلسل التقاط الصورة، اضغط على زر التشغيل لبدء الحصول على الصورة بعد الاستحواذ

يمكن قياس معلمات الترحيل مثل السرعة وطول المسار والإزاحة باستخدام حزمة برامج مثل Image J Auto Quant أو veloc. لإنشاء مخطط شبكة العنكبوت ، اجمع إحداثيات XY لكل خلية ونقطة زمنية وقم بعرضها على رسم بياني مع نقطة بداية مشتركة لكل خلية في الأصل. تم زراعة الخلايا الليمفاوية التائية الموضحة هنا على ICAM و SDF واحد وتم تصويرها كل 10 ثوان لمدة 30 دقيقة.

يظهر هذا الفيلم الهجرة العشوائية للخلايا الليمفاوية التائية بسرعة تقارب 15 ميكرون في الدقيقة باستخدام إحداثيات XYT لكل خلية. تم اختيار 15 خلية عشوائيا ورسمها بنقطة انطلاق مشتركة في الأصل. تعطي مقارنة مخططات شبكة العنكبوت تصويرا مرئيا سريعا للاختلافات في الهجرة بين الظروف التجريبية المختلفة.

مؤامرات هجرة الخلايا الليمفاوية التائية في ظل ظروف التحكم على اليسار بينما تظهر مخططات هجرة الخلايا الليمفاوية التائية في وجود جسم مضاد مضاد مضاد للرابطة LFA واحد على اليمين. توضح هذه البيانات أن الخلايا الليمفاوية التائية تستخدم إنتجرين LFA واحد للهجرة على ركيزة ICAM واحدة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء فحص الهجرة باستخدام الخلايا الليمفاوية التائية البشرية المستنبتة أثناء العملية.

من المهم أن تتذكر إضافة عدد مناسب من الخلايا إلى طبق مطلي واحد من ICAM بحيث يتم تبسيط تتبع الخلايا وتحليل الهجرة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.