عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا بطانية لمفاوية عالية النقاء تبطن الأوعية اللمفاوية في التشوهات اللمفاوية البشرية والقلفة باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الهضم الإنزيمي لعينة من أنسجة المريض. وفي الخطوة الثانية، يتم استزراع معلق الخلايا المفردة لإثراء عدد الخلايا البطانية اللمفاوية.

في العينة. بعد ذلك يتم وسم الخلايا باستخدام أجسام مضادة لعلامات سطح الخلية المستهدفة، ثم يتم فرزها باستخدام الفرز الخلوي النشط بالفلورة متعدد المعلمات. وفي نهاية المطاف، يمكن توسيع الخلايا البطانية اللمفاوية من القلفة والتشوهات اللمفاوية في المزارع الخلوية لإجراء المزيد من التحليلات اللاحقة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن فرز الخلايا المنشط بالفلورة ينتج خلايا بنقاء يتجاوز 99%، مما يتجنب المشكلات المرتبطة بفقدان الخلايا البطانية اللمفاوية نتيجة نمو الخلايا الملوثة بشكل مفرط. ابدأ بوزن أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على 10 milliliters من الوسط الغذائي المكمل بمحلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات. ثم انقل عينة التشوه اللمفاوي أو عينة الجلد إلى الأنبوب وزن الأنبوب مرة أخرى لتحديد وزن النسيج.

بعد ذلك، وفي كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية، استخدم ملاقط معقمة لنقل النسيج والوسط إلى طبق زراعة أنسجة بقطر 100 مليمتر باستخدام مقصات معقمة. أخيراً، قم بتقطيع النسيج إلى قطع بحجم واحد مليمتر مكعب. ثم انقل القطع إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 مليلتر من وسط مضاد حيوي ومضاد للفطريات طازج.

قم بتحريك الأنبوب بشكل دائري بضع مرات لإعادة تعليق النسيج، ثم قم بطرد العينة مركزياً. بعد إزالة السائل الطافي، أضف 1 mL من محلول الهضم المسخن مسبقاً لكل 100 mg من النسيج المفروم، ثم قم بحضن النسيج في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C مع الرج المستمر بسرعة 200 RPM. ومن أجل الإثراء الناجح للخلايا البطانية اللمفاوية، من الضروري تحديد الوقت الذي تعرضت فيه الخلايا بشكل كافٍ لإنزيم collagenase وتفاعل dys space لضمان بقائها على قيد الحياة أثناء عملية العزل.

يتحقق ذلك من خلال المراقبة الدقيقة لعملية هضم الأنسجة وإيقاف التفاعل عندما يتم هضم معظم الأنسجة إلى شظايا دقيقة. وفي نهاية فترة الحضن، تأكد من هضم جميع الأنسجة تقريباً إلى شظايا صغيرة، ثم قم بترشيح ملاط الأنسجة عبر مصفاة بمسامية 70 micron في أنبوب معقم سعة 50 milliliter. الآن، استخدم مكبس حقنة سعة three milliliter بمكبس مطاطي لطحن ما تبقى من الأنسجة حتى لا يتبقى سوى آثار صغيرة من المصفوفة خارج الخلوية.

بعد ذلك، اغسل مصفاة الخلايا بحجم من وسط الخلايا البطانية يعادل حجم وسط إنزيم التفكيك، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى. علّق الراسب في ما يصل إلى 20 milliliters من وسط الخلايا البطانية، وذلك حسب حجم العينة. ثم بعد العد، ازرع 2 × 10⁶ من الخلايا في دورق بمساحة 150 square centimeter مطلي مسبقاً بالفيبرونيكتين (fibronectin) في حجم نهائي قدره 20 milliliters من وسط الخلايا البطانية من أجل الاستزراع طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، اغسل الخلايا غير المرتبطة بثلاث شطفات من PBS المضاف إليه محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات. ثم، لزيادة عدد الخلايا البطانية اللمفاوية، أضف وسط استزراع الخلايا البطانية الطازج إلى الخلايا، واحضن المزرعة لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام حتى تصل درجة تلاقي الخلايا إلى حوالي 80%. صبغ الخلايا لفرزها بواسطة فرز الخلايا المنشط بالفلورة متعدد المعايير.

أولاً، قم بإزالة وسط الخلايا، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف سبعة ملليلترات من محلول الفصل بعد تحضين لمدة خمس إلى سبع دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بحصاد الخلايا المفككة، وقم بتثبيط عمل الإنزيمات بإضافة ثلاثة أحجام من وسط الخلايا البطانية، وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب معقم.

قم بطرد الخلايا مركزياً ثلاث مرات مع غسل الراسب في 5 mL من PBS في دورتي الطرد الثانية والثالثة بعد الغسلة الأخيرة. أعد تعليق الراسب في 5 mL من PBS جديد واحسب عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد صبغة tripan blue. بعد عد الخلايا.

انقل الخلايا بطريقة معقمة إلى أنابيب صبغ قياس التدفق الخلوي، وقم بطرد الخلايا مركزياً لترسيبها من أجل حجب الارتباط غير النوعي. أعد تعليق الخلايا في 5%F-B-S-P-B-S، واحضنها على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد عملية الطرد المركزي للحجب، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق الخلايا.

قم بتعليق الراسب في كوكتيل من أجسام مضادة لـ CD 34 وCD 31 potanin ومستقبل VEGF الثالث. بعد 20 دقيقة على الثلج، اغسل الخلايا ثلاث مرات في 2 milliliters من F-B-S-P-B-S لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة وأعد التعليق. قم بتعليق الراسب في 300 microliters من يوديد البروبيديوم في محلول F-B-S-P-B-S على الثلج.

أخيراً، قم بفرز الخلايا البطانية اللمفاوية البشرية المنقاة باستخدام جهاز فرز الخلايا المنشط فلوريسينياً متعدد المعايير. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا المفرزة مركزياً، ثم أعد تعليق الرواسب في الوسط المناسب لاستزراع الخلايا. تظهر هنا أوعية لمفاوية بشرية طبيعية وأوعية تشوه لمفاوي موسومة بجسم مضاد ضد podoplanin؛ لاحظ التوسع الملحوظ والتباين الكبير في حجم التجويف داخل أوعية التشوه اللمفاوي البشري.

في الواقع، تحتوي معظم التشوهات اللمفاوية على هياكل كيسية غير طبيعية صغيرة أو مجهرية التكيس وكبيرة أو كبيرة التكيس بعد الهضم الأولي للأنسجة و24 ساعة من الزرع في العينات غير المجزأة. ويمكن ملاحظة مستعمرات متميزة من الخلايا البطانية بالإضافة إلى الخلايا الشبيهة بالأرومات الليفية وخلايا العضلات الملساء بعد الفرز ومرور 24 ساعة أخرى في المزرعة الخلوية. ومع ذلك، فإن الخلايا الموجبة لـ CD 34، والمنخفضة الإيجابية لـ CD 31 والموجبة لمستقبل VEGF الثالث تلتصق بوعاء الزرع وتظهر شكل "رصيف الشارع" النموذجي الملاحظ في هذه الصور.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا البطانية اللمفاوية التي تبطن التشوهات اللمفاوية البشرية والأوعية اللمفاوية الجلدية الكاملة بنقاء عالٍ باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة. لا تنسَ أن العمل مع الأنسجة البشرية الأولية قد يكون خطيراً لأنها قد تحتوي على عوامل معدية ضارة بصحة الإنسان. يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات القياسية مثل ارتداء القفازات، والنظارات الواقية، ومآزر المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.