عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا البطانية اللمفاوية عالية النقاء التي تبطن الأوعية اللمفاوية للتشوهات اللمفاوية البشرية والقلفة باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق هضم عينة من أنسجة المريض إنزيميا. في الخطوة الثانية ، يتم زراعة معلق الخلية المفردة لإثراء عدد الخلايا البطانية اللمفاوية.

في العينة. ثم يتم تصنيف الخلايا بأجسام مضادة لعلامات سطح الخلية ذات الأهمية وفرزها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة متعددة المعلمات. في النهاية ، يمكن توسيع القلفة والتشوه اللمفاوي والخلايا البطانية اللمفاوية في زراعة الخلايا لمزيد من التحليل النهائي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ينتج عن خلايا أكبر من 99٪ نقاء ، مما يتجنب المشاكل المرتبطة بفقدان الخلايا البطانية اللمفاوية بسبب فرط النمو عن طريق تلويث الخلايا. ابدأ بوزن أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من الوسط ، مكملا بمحلول مضاد حيوي مضاد للفطريات. ثم انقل التشوه اللمفاوي أو أربع عينات من الجلد إلى الأنبوب وقم بوزن الأنبوب مرة أخرى لتحديد وزن الأنسجة.

بعد ذلك ، في خزانة السلامة الحيوية من الدرجة الثانية ، استخدم ملقطا معقما لنقل الأنسجة والوسط إلى طبق زراعة الأنسجة 100 ملم باستخدام مقص معقم. أخيرا ، افرم الأنسجة إلى قطع ملليمتر مكعب واحد. ثم انقل القطع إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مع 10 ملليلتر من مضادات الحيوية الطازجة المضادة للفطريات. متوسط.

قم بتدوير الأنبوب عدة مرات لإعادة تعليق الأنسجة ثم قم بتدوير العينة. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الهضم الدافئ لكل 100 ملليغرام من الأنسجة المفرومة واحتضان الأنسجة في حاضنة 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 200 دورة في الدقيقة لإثراء الخلايا البطانية اللمفاوية بنجاح. من الأهمية بمكان التعرف على متى تعرضت الخلايا بشكل كاف لتفاعل الكولاجيناز وخلل في الفضاء حتى تنجو من العزلة.

يتم تحقيق ذلك من خلال المراقبة الدقيقة لعملية هضم الأنسجة وإيقاف التفاعل عندما يتم هضم معظم الأنسجة إلى شظايا دقيقة. في نهاية الحضانة ، تأكد من أن جميع الأنسجة تقريبا قد هضمت إلى شظايا صغيرة وقم بتصفية ملاط الأنسجة من خلال مصفاة 70 ميكرون في أنبوب معقم سعة 50 مل. استخدم الآن مكبس حقنة سعة ثلاثة ملليلتر مع مكبس مطاطي لطحن الأنسجة المتبقية حتى يتم ملاحظة آثار صغيرة فقط للمصفوفة خارج الخلية.

ثم اغسل مصفاة الخلية بحجم من وسط الخلية البطانية يعادل حجم وسط الإنزيم المفكك وقم بتدوير الخلايا الرئيسة. الحبيبات في ما يصل إلى 20 مل من وسط الخلية البطانية ، اعتمادا على حجم العينة. ثم بعد عد البذور ، مرتين في 10 إلى الخلايا الست في قارورة مساحتها 150 سنتيمترا مربعا مشفرة مسبقا بالفبرونيكتين في حجم نهائي قدره 20 مل من وسط الخلية البطانية للزراعة الليلية.

في صباح اليوم التالي ، اغسل الخلايا غير المنضومة بثلاث شطفات من PBS مكملة بمحلول مضاد للفطيات بالمضادات الحيوية. ثم لتوسيع عدد الخلايا البطانية اللمفاوية ، أضف وسط الخلية البطانية الجديدة إلى الخلايا ، واحتضان المزرعة لمدة خمسة إلى سبعة أيام حتى تصبح الثقافة حوالي 80٪. لتلطيخ الخلايا للفرز عن طريق فرز الخلايا المضان متعدد المعلمات.

أولا ، قم بإزالة وسائط الخلية ، واغسل الخلايا ثلاث مرات في PBS. ثم أضف سبعة ملليلتر من محلول الانفصال بعد خمس إلى سبع دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية. احصد الخلايا المنفصلة ، وقم بتعطيل الإنزيمات بثلاثة أحجام من وسط الخلية البطانية ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم.

الطرد المركزي للخلايا ثلاث مرات غسل الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS للدورات الثانية والثالثة بعد الغسيل الأخير. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS الطازج واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد trian blue. بعد عد الخلايا.

انقل الخلايا بشكل معقم إلى أنابيب تلطيخ قياس التدفق الخلوي ، وتدور الخلايا لمنع الارتباط غير المحدد. أعد تعليق الخلايا في 5٪ F-B-S-P-B-S ، واحتضانها على الجليد لمدة 20 دقيقة. بعد منع أجهزة الطرد المركزي ، تزيل الخلايا المادة الطافية والريسوس.

قم بتعليق الحبيبات في CD 34 و CD 31 potanin و VEGF ثلاثة كوكتيل أجسام مضادة. بعد 20 دقيقة على الثلج ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في ملليلترين من F-B-S-P-B-S لإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط وإعادة التغذية. الحبيبات في 300 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم في محلول F-B-S-P-B-S على الجليد.

أخيرا ، قم بفرز الخلايا البطانية اللمفاوية البشرية المنقاة على أداة فرز الخلايا المنشطة متعددة المعلمات. ثم قم بتدوير الخلايا التي تم فرزها وقم بتعليق الكريات في الوسط المناسب لبذر زراعة الخلايا. هنا ، تظهر أوعية التشوه اللمفاوي واللمفاوي البشرية الطبيعية المسمى بجسم مضاد ضد انزلاق الوعاء لاحظ التمدد الملحوظ والتباين الكبير في حجم التجويف داخل أوعية التشوه اللمفاوي البشري.

في الواقع ، تحتوي معظم التشوهات اللمفاوية على هياكل كيسية غير طبيعية صغيرة أو ميكروكيسية وكبيرة أو كيسية كبيرة بعد الهضم الأولي للأنسجة و 24 ساعة من الثقافة في العينات غير المجزأة. يمكن ملاحظة مستعمرات الخلايا البطانية المميزة بالإضافة إلى الخلايا الليفية الشبيهة بالخلايا وخلايا العضلات الملساء بعد الفرز و 24 ساعة أخرى في زراعة الخلايا. ومع ذلك ، فإن CD 34 ، وانخفاض CD 31 إيجابي مستقبلات VEGF ثلاثة مستويات بودو إيجابية وخلايا موجبة متصلة بحاوية الثقافة وتظهر مورفولوجيا الحصى النموذجية التي لوحظت في هذه الصور.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلية البطانية اللمفاوية التي تبطن التشوه اللمفاوي البشري والأوعية اللمفاوية الكاملة للجلد بنقاء عال باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية الأولية يمكن أن يكون خطيرا لأنه قد يحتوي على عوامل معدية ضارة بصحة الإنسان. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات القياسية مثل ارتداء القفازات والنظارات الواقية وثوب المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.