تصور المتماثل الحمض النووي في خلايا فردية عن طريق تضخيم الإشارات EDU

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية وتصور تكرار M-T-D-N-A في الخلايا العصبية المستزرعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان الخلايا العصبية أولا باستخدام EDU التناظري للثيميدين لمدة ساعتين إلى 24 ساعة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تسمية EDU الذي يحتوي على ألكين مع الأزيد الفلوري الأورغون الأخضر 4 88 من خلال تفاعل تساهمي محفز نحاسي.

تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تضخيم إشارة الأورغون الخضراء مع خطوة تضخيم إشارة الأراميد من أجل تصور EDU الذي تم دمجه في MT DNA المركب حديثا. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تكرار الحمض النووي MT في مقصورات فرعية محددة من الخلايا العصبية من خلال الجمع بين كيمياء clicka EDU وتضخيم إشارة العقل المسيل للدموع اللاحقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل وضع العلامات BRDU ، هي أن وضع العلامات على EDU أسهل وأكثر اعتدالا ، مما يسمح بتلطيخ إضافي للعلامات العصبية الفلورية المناعية.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تنظيم عدد الميتوكوندريا ، مثل كيفية تلبية الخلايا العصبية لأحمال الطاقة المتغيرة في مقصوراتها تحت الخلوية ، بما في ذلك أجسام الخلايا والمحاور والتشعبات والطرف المتشابك. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للآليات الكامنة وراء التسبب في الأمراض العصبية المتعددة القائمة على الميتوكوندريا ، بما في ذلك الاعتلال العصبي والتنكس العصبي. ولكن الأهم من ذلك ، أنه يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى حيث من المحتمل أن تكون التغييرات في نسخة الحمض النووي للميتوكوندريا تكمن وراء التسبب في حالة المرض ، بما في ذلك سمية الأدوية والسرطان والشيخوخة.

سيوضح هذا الفيديو كيفية تسمية الحمض النووي للميتوكوندريا المركب حديثا باختصار M-T-D-N-A في الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية التي نمت على زلات غطاء زجاجي معقمة مقاس 12 ملم. في صفيحة استزراع 24 بئر ، قم بتخفيف مخزون 10 مللي مولار من خمسة إيثانول اثنين من دوكسي يوريدين ، المختصرة EDU من مجموعة فحص Clicka EDO Microplate من واحد إلى 100 في وسط الاستزراع لمخزون 10 XEDU. ثم يضاف مخزون 10 XEDU مباشرة إلى الوسط في كل بئر يحتضن الخلايا العصبية المعالجة لمدة ساعتين إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في غطاء الدخان.

قم بإصلاح الخلايا العصبية في 2٪ ألدهيد Paraform لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل مرتين في XPBS لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق لكل غسلة. يمكن تخزين الخلايا العصبية الثابتة في واحدة جديدة XPBS عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

قم بإعداد غرفة رطبة كما هو موضح في النص المصاحب. استخدم ملقطا ذا رؤوس دقيقة لنقل 28 زلة غطاء ثابتة ، بما في ذلك عناصر التحكم في EDU الإيجابية والسالبة إلى صفائح من الطفيلي M الكارهة للماء داخل الغرفة الرطبة. أعد وضع 200 إلى 300 ميكرولتر من XPBS واحد لتغطية سطح كل زلة غطاء.

قم بإعداد مجموعة فحص النقر على القرص كما هو موضح في النص والمصنعين والتعليمات لتسمية الحمض النووي للميتوكوندريا عند 75 إلى 80 ميكرولتر من محلول قابل للاختراق يحتوي على 0.1٪ tritton X في XPBS واحد لكل غطاء ، وانزلاق ، وتغطية ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استخدم ماصة نقل المصباح مع لصق طرف سعة 200 ميكرولتر في النهاية. لإزالة السائل بلطف دون فقدان الخلايا.

استخدم ماصة لمبة لإغراق الغطاء برفق. انزلق مع 200 إلى 300 ميكرولتر من XPBS واحد لغسل المحلول السابق تماما. اغسل كل زلة غطاء مرتين.

ماصة 75 إلى 80 ميكرولترا من بيروكسيد الهيدروجين الطازج بنسبة 1٪ في XPBS واحد على كل زلة غطاء. احتضان مغطى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي. اشطفها مرتين باستخدام XPBS كما كان من قبل ، قم بإعداد كوكتيل النقر عند التفاعل كما هو مفصل في النص المصاحب.

قم بتثبيتها لأعلى ولأسفل للخلط. لا تقم بدوامة التثبيت على الخلايا العصبية ب 75 إلى 80 ميكرولترا من النقر عند مثبت EDU لكل زلة غطاء تحتضن درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء حضانة postfix ، قم بتخفيف كوكتيل التفاعل بحجم متساو من مثبت EDU.

أضف كوكتيل التفاعل إلى كل غطاء زلة للحماية من الضوء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. قم بإزالة غسول كوكتيل التفاعل برفق مرتين باستخدام مخزن مؤقت مخفف واحد × تحت مجهر فلورسنت epi. تحقق من وجود تلطيخ أخضر أورجون في النوى عند اكتمال تلطيخ EDU.

ابدأ تضخيم إشارة النمل الأبيض أو أضف TSA 1٪ محلول كتلة TSA إلى كل زلة غطاء واحتضان درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بتدوير مخزون الأجسام المضادة المترافق بالفجل الأخضر للحصان الأخضر لفترة وجيزة ، تم تحضيره قبل ساعتين إلى 24 ساعة من TSA ، وقم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي من واحد إلى 300 في محلول حجب TSA وعكس أو ماصة لخلط دوامة عقدة الضبط. أضف 75 ميكرولترا إلى كل غطاء ، وانزلق واحتضن عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، اشطف ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد في درجة حرارة الغرفة. احتضن زلات الغطاء في الغسيل النهائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة إضافية لضمان إزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط. قم بإعداد تفاعل IDE وفقا لجزء النص من هذا البروتوكول مباشرة قبل الاستخدام.

احتضان زلات الغطاء مع تفاعل IDE لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات مع حضنة XPBS واحدة في الغسيل النهائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة كما كان من قبل تحت المجهر. تحقق من وجود MT DNA وضع العلامات على الخلايا العصبية الملطخة بنجاح على الشرائح الزجاجية مع وسيط تركيب ANTIFA الذي يحتوي على DPI الموضحة هنا هي صور تباين التداخل التفاضلي التمثيلية للخلايا العصبية العقدية الجذرية الجنينية والبالغة التي تستخدم عادة للتحليل.

تمثل هذه المخططات التخطيطية إجراء تسمية EDU في MTD NA بإشارة فلورية خضراء. تعمل خلايا الورم الأرومي العصبي F 11 النشطة انقساميا كعنصر تحكم إيجابي وتوضح نمط وضع العلامات على EDU الذي تم دمجه في الحمض النووي النووي والميتوكوندريا في هذه الصور الفلورية التمثيلية المتراكبة فوق المجال الساطع. تظهر الإشارات النقطية الخضراء إشارة EDU المضخمة المدمجة في M-D-D-N-A المركب حديثا لكل من الخلايا العصبية العقدية الجذرية الجنينية والبالغة.

يسمح إجراء وضع العلامات على EDU بالتلوين المناعي الفلوري اللاحق للعلامات العصبية مثل الخيوط العصبية باللون الأحمر. تمثل هذه المخططات التخطيطية إجراء تسمية EDU و MTD NA بإشارة فلورية حمراء. تعمل خلايا الورم الأرومي العصبي F 11 النشطة انقساميا كعنصر تحكم إيجابي وتوضح نمط وضع العلامات على EDU الذي تم دمجه في الحمض النووي النووي والميتوكوندريا.

يمثل هذا الرسم البياني التخطيطي إجراء تسمية BRDU في M-T-D-N-A المركب حديثا بإشارة فلورية خضراء أو حمراء. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تشغيل عناصر التحكم باستخدام الخلايا النشطة انقساميا للتحقق من نجاح تصنيف EDU ونواة الخلية قبل المتابعة إلى خطوات التضخيم لتصور وسم MT DNA باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي القياسي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تنظيم تخليق الحمض النووي للميتوكوندريا في مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا العصبية أو المقصورات العصبية نظرا لتطورها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف تنظيم عدد الميتوكوندريا في نماذج الثقافة لكل من علم وظائف الأعضاء الطبيعي وكذلك نماذج الثقافة التي تحاكي المرض الضعيف.

الدول العصبية.