تصور المتماثل الحمض النووي في خلايا فردية عن طريق تضخيم الإشارات EDU

الهدف العام من هذا الإجراء هو وسم وتصوير تضاعف M-T-D-N-A في الخلايا العصبية المستزرعة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضين الخلايا العصبية مع نظير الثيميدين EDU لمدة تتراوح من ساعتين إلى 24 ساعة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في وسم EDU الذي يحتوي على ألكين باستخدام صبغة orgon green 4 88 azide الفلورية من خلال تفاعل تساهمي محفز بالنحاس.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تضخيم إشارة orgon green عبر خطوة تضخيم إشارة aramide من أجل تصور EDU الذي تم دمجه في MT DNA المصنع حديثاً. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تضاعف MT DNA في مقصورات فرعية خلوية محددة من العصبونات من خلال الجمع بين كيمياء clicka EDU وتضخيم إشارة tear mind اللاحق. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الموجودة مثل وسم BRDU في أن وسم EDU أسهل وأكثر رفقاً، مما يسمح بإجراء صبغ مناعي فلوري إضافي للمؤشرات العصبونية.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة عن أسئلة رئيسية في تنظيم عدد الميتوكوندريا، مثل كيفية تلبية الخلايا العصبية لأحمال الطاقة المتغيرة في مقصوراتها تحت الخلوية، بما في ذلك أجسام الخلايا، والمحاور، والزوائد الشجرية، والنهايات التشابكية. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة في الآليات الكامنة وراء إمراضية العديد من الأمراض العصبية القائمة على الميتوكوندريا، بما في ذلك الاعتلال العصبي والتحلل العصبي. ولكن الأهم من ذلك، أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى حيث من المرجح أن تؤدي التغيرات في عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا إلى إمراضية الحالة المرضية، بما في ذلك سمية الأدوية، والسرطان، والشيخوخة.

سيوضح هذا الفيديو كيفية وسم الحمض النووي الميتوكوندري المُصنّع حديثاً، والمشار إليه اختصاراً بـ M-T-D-N-A، في عصبونات العقد الجذرية الظهرية التي تم استزراعها على شرائح غطاء زجاجية معقمة بقطر 12 ملم. في طبق استزراع مكون من 24 بئراً، يتم تخفيف المخزون بتركيز 10 ميلي مولار من 5-إيثينيل-2'-ديوكسي يوريدين، والمشار إليه اختصاراً بـ EDU من طقم مقايسة Clicka EDO Microplate، بنسبة 1 إلى 100 في وسط الاستزراع للحصول على مخزون EDU بتركيز 10X. ثم يُضاف مخزون EDU بتركيز 10X مباشرة إلى الوسط في كل بئر، وتُحضن العصبونات المعالجة لمدة تتراوح من 2 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% carbon dioxide داخل خزانة استخلاص الغازات.

ثبّت الخلايا العصبية في 2% Paraform aldehyde لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسلها مرتين في one XPBS لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق لكل غسلة. يمكن تخزين الخلايا العصبية المثبتة في one XPBS طازج عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

قم بتحضير غرفة رطوبة كما هو موضح في النص المصاحب. استخدم ملقطاً دقيق الطرف لنقل 28 شريحة غطاء مثبتة، بما في ذلك ضوابط EDU الإيجابية والسلبية، إلى شرائح من البارافورم الكاره للماء M داخل غرفة الرطوبة. أضف من 200 إلى 300 microliters من محلول XPBS لتغطية سطح كل شريحة غطاء.

قم بتحضير مجموعة اختبار click it كما هو موضح في النص وتعليمات الشركة المصنعة لوسم الحمض النووي الميتوكوندري عن طريق إضافة 75 إلى 80 µL من محلول نفاذ يحتوي على 0.1%tritton X في 1XPBS إلى كل شريحة غطاء، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. استخدم ماصة نقل ذات بصلة مثبت بها طرف سعة 200 µL لإزالة السائل برفق دون فقدان الخلايا.

استخدم ماصة ذات بصلة لغمر الغطاء برفق. أضف من 200 إلى 300 µL من محلول XPBS لغسل المحلول السابق تماماً. اغسل كل شريحة غطاء مرتين.

قم بسحب 75 إلى 80 µL من بيروكسيد الهيدروجين الطازج بتركيز 1% في one XPBS وضعها على كل شريحة غطاء. يتم التحضين مع التغطية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإخماد نشاط البيروكسيداز الداخلي. اشطف الشريحة مرتين باستخدام one XPBS كما سبق، ثم قم بتحضير كوكتيل تفاعل الكليك (click reaction cocktail) طازجاً كما هو مفصل في النص المرفق.

استخدم الماصة للسحب والضخ لخلط المزيج. لا تستخدم جهاز هزاز الأنابيب (vortex). قم بتثبيت الخلايا العصبية لاحقاً بإضافة من 75 إلى 80 µL من مثبت click-EDU لكل شريحة غطاء، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وأثناء فترة حضن التثبيت اللاحق، قم بتخفيف كوكتيل التفاعل بحجم مساوٍ من مثبت click-EDU.

أضف مزيج التفاعل إلى كل غطاء شريحة للحماية من الضوء، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. قم بإزالة مزيج التفاعل برفق واغسله مرتين باستخدام محلول حجب (blocking buffer) مخفف بتركيز one x تحت مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescent microscope). تحقق من صبغ النوى بـ orgon green عند اكتمال صبغ EDU.

ابدأ عملية تضخيم إشارة الترميت (TSA) بإضافة محلول حجب TSA بتركيز 1% إلى كل شريحة غطاء، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بتدوير مخزون الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتين والمقترنة ببيروكسيداز الفجل الحصري (horseradish peroxidase) الملون باللون الأخضر لفترة وجيزة. قم بتحضير الأجسام المضادة الأولية قبل 2 إلى 24 ساعة من عملية TSA، حيث يتم تخفيف الجسم المضاد الأولي بنسبة 1 إلى 300 في محلول حجب TSA، ثم اقلب الأنبوب أو استخدم الماصة للمزج بدلاً من استخدام جهاز الرج (vortex). أضف 75 µL إلى كل شريحة غطاء وحضنها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم الشطف ثلاث مرات باستخدام XPBS في درجة حرارة الغرفة. تُحضن الشرائح الغطائية في الغسلة الأخيرة لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة إضافية لضمان إزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة. يتم تحضير تفاعل IDE وفقاً للجزء النصي من هذا البروتوكول مباشرة قبل الاستخدام.

يتم تحضين شرائح الغطاء مع تفاعل IDE لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تُغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام XPBS، مع التحضين في الغسلة الأخيرة لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة كما سبق تحت المجهر. يتم التحقق من وسم DNA للميتوكوندريا (MT DNA)، ثم تُثبَّت الخلايا العصبية المصبوغة بنجاح على شرائح زجاجية باستخدام وسط تثبيت ANTIFA يحتوي على DPI. تظهر هنا صور ممثلة بتباين التداخل التفاضلي (DIC) لخلايا عصبية من العقد الجذرية الظهرية الجنينية والبالغة التي تُستخدم عادةً في التحليل.

تمثل هذه المخططات التوضيحية إجراء وسم EDU في MTD NA بإشارة فلورية خضراء. وتعمل خلايا الورم الأرومي العصبي F 11 النشطة انقسامياً كعينة ضابطة موجبة، وتوضح نمط وسم EDU الذي تم دمجه في الحمض النووي النووي والميتوكوندري في هذه الصور الفلورية التمثيلية المتراكبة فوق حقل مضيء. وتظهر الإشارات النقطية الخضراء إشارة EDU المضخمة والمدمجة في M-D-D-N-A المصنع حديثاً في كل من عصبونات العقد الجذرية الظهرية الجنينية والبالغة.

تتيح عملية وسم EDU إجراء صبغ مناعي فلوري لاحق لعلامات عصبية مثل خيوط العصب (neurofilament) باللون الأحمر. وتمثل هذه المخططات التوضيحية إجراء وسم EDU وMTD NA بإشارة فلورية حمراء. وتعمل خلايا الورم الأرومي العصبي F 11 النشطة انقسامياً كعينة ضابطة موجبة، حيث توضح نمط وسم EDU الذي تم دمجه في الحمض النووي الريبوزي النووي والميتوكوندري.

يمثل هذا المخطط التوضيحي إجراء وسم BRDU في M-T-D-N-A المصنّع حديثاً باستخدام إشارة فلورية خضراء أو حمراء. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تشغيل ضوابط باستخدام خلايا نشطة انقسامياً للتحقق من نجاح وسم EDU ونوى الخلايا قبل الانتقال إلى خطوات التضخيم لتصور وسم MT DNA المتبع في هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التألق المناعي القياسي للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تنظيم تخليق الحمض النووي للميتوكوندريا في مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية أو أجزاء عصبية معينة. وبفضل تطوير هذه التقنية، ستُمهد الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا العصبية لاستكشاف تنظيم عدد الميتوكوندريا في نماذج زراعة الأنسجة لكل من الفسيولوجيا الطبيعية وكذلك نماذج الزراعة التي تحاكي المرض المختل.

الحالات العصبية.