المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

الهدف العام من الإجراء التالي هو تحديد التوطين الخضوع لدورة الخلية النووية كيناز عادة ثم تحليل كيفية تأثير توطين الميتوكوندريا على تقدم دورة الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الميتوكوندريا ، مثل كيفية تواصل النواة مع الميتوكوندريا أثناء دورة الخلية. من خلال وضع علامات على البروتينات بتسلسل رائد للميتوكوندريا ، يمكننا الاستفادة على وجه التحديد من التعبيرات في البروتين في الميتوكوندريا ، حتى نتمكن من دراسة وظائفها الخاصة بالميتوكوندريا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستهداف الميتوكوندريا لبروتينات معينة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على العضيات الأخرى ، مثل النواة ، و ER ، و golgi ، والليزوزوم. بعد زراعة الخلايا وتجانسها وتكويرها وفقا لبروتوكول النص ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. والطرد المركزي للعينة عند 7 ، 000 جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المثلج للسوائب البارد لإعادة تعليق الحبيبات ، وتقسيم الجانس إلى قسمين. الطرد المركزي للعينات مرة أخرى عند 7 ، 000 جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. وكرر الغسيل.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا إلى إحدى الكريات ، وقم بتخزين المحللة عند 80 درجة مئوية للنشاف المناعي. لإجراء استخراج كربونات الصوديوم باستخدام الحبيبات الثانية لفصل البروتينات القابلة للذوبان والمرتبطة بالغشاء ، أضف 250 ميكرولتر من 0.1 مولار كربونات الصوديوم درجة الحموضة 11.0 ، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 100 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة.

ثم اجمع المادة الطافية وأضف كمية متساوية من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك الطازج بنسبة 20٪ لترسيب البروتينات. يحفظ على الثلج لمدة 30 دقيقة. في غضون ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا إلى الحبيبات وصوتنة وفقا لبروتوكول النص قبل تخزينه عند 80 درجة مئوية للنشاف المناعي.

بعد حضانة TCA لمدة 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للتفاعل عند 15 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، ثم استخدم 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا لإعادة تعليق الحبيبات. بعد عزل كسور الميتوكوندريا عن الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص ، افصل كسور الميتوكوندريا إلى 10 أجزاء متساوية.

حبيبات العينات على حرارة 7 ، 000 جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استخدم 30 ميكرولترا من مجموعة من تركيزات مخازن السكروز ناقص التوتر مع أو بدون التربسين ، لإذابة كل حبيبات. واحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة.

أضف 3 ميكرولترات من 10 مللي مولار PMSF إلى القوارير المحتوية على التربسين لوقف هضم التربسين. واحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي للعينات على حرارة 14 ، 000 جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. لتحلل الحبيبات ، أضف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا. قم بتقطيع العينات كما هو موضح في بروتوكول النص وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية.

لبناء نواقل cyclinB-1 Cdk-1 المستهدفة للميتوكوندريا GFP / RFP ، قم باستنساخ تسلسل استهداف الميتوكوندريا من مقدمة الوحدة الفرعية للأكسيديز السيتوكروم-ج البشري 8A ، وقم بتأطير الطرف n ل GFP أو RFP في مواقع Nhe1 و bAmH1 ، من pEGFP-N1 أو pERFP-N1 ، باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية. باستخدام البادئات الموضحة في بروتوكول النص ، قم بتضخيم جينات Cdk1 و cyclinB1 باتباع التقنيات القياسية. ثم استخدم BamH1 لهضم منتجات PCR.

قم بتشغيل التفاعلات على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ، قبل استخدام شفرة حلاقة لقطع شظايا الحمض النووي ذات الحجم الصحيح. ثم استخدم مجموعة استخراج الجل لتنقية الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بهضم ميكروغرام واحد من بلازميدات MTS-pEGFP-N1 و MTS-pERFP-N1 مع 1 ميكرولتر من BamH1 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

ثم أضف 1 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي المعوي في ربلة الساق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد تشغيل منتجات الهضم على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ وتنقية الحمض النووي كما هو موضح للتو ، قم بإعداد تفاعل ربط باستخدام الكواشف المدرجة في بروتوكول النص. ثم احتضان التفاعل عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.

تحويل ه. قولونية dH5-ألفا الخلايا المختصة ب 10 ميكرولتر من خليط الربط. وتنمو البكتيريا على أطباق LB أجار بالإضافة إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر من الكاناميسين عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، استخدم طرف ماصة معقمة لاختيار مستعمرة من طبق. وأدخل الطرف في أنبوب يحتوي على 5 ملليلتر من LB kanamycin. احتضن المزرعة بين عشية وضحاها وفي صباح اليوم التالي ، استخدم مجموعة تحضيرية صغيرة وفقا لبروتوكول النص لعزل البلازميد.

لنقل خلايا MCF-10A التي تنمو بشكل كبير ، استخدم بلازميدات Cdk1 أو cyclinB-1 لإعداد كاشف تعداء البلازميد بنسبة 1: 2 في 100 ميكرولتر من المصل والوسط الخالي من المضادات الحيوية. قم بنقل الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تلطيخ الميتوكوندريا وتصورها وفقا لبروتوكول النص.

لإجراء فرز الخلايا ، قم بنقل الخلايا 2 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة مع النواقل المرغوبة في صفيحة مكونة من 6 آبار باستخدام نسبة 1: 2 من الحمض النووي إلى كاشف النقل المحضر في 2.5 مل من المصل والوسط الخالي من المضادات الحيوية. بعد احتضان التعدي لمدة 48 ساعة ، استخدم قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا بثبات للكشف عن بروتينات Cdk-1 وبروتينات clyclinB1 التي تحمل علامة GFP وفقا لبروتوكول النص. لقياس طول دورة الخلية باستخدام مقايسة قياس التدفق الخلوي لوضع العلامات EdU ، قامت البذور بفرز الخلايا في ألواح مكونة من 6 آبار بكثافة 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر.

بعد حضانة ليلية ، أضف EdU إلى وسط الاستزراع بتركيز نهائي يبلغ 25 ميكرومولار واحتضنه لمدة ساعة إضافية. ثم على فترات ساعتين ، استخدم 1٪ BSA في 500 ميكرولتر من PBS لغسل بئر واحد من الخلايا. وجمعها في أنبوب سعة 1.5 مل.

الطرد المركزي للخلايا على حرارة 350 جم لمدة 5 دقائق. ثم تخلص من الطافف. قم بإزاحة الحبيبات بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت.

تخلط جيدا وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، استخدم 1 مليلتر من 1٪ BSA في PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات. ثم استخدم 0.5 مل من 70٪ من الإيثانول لإصلاح الخلايا عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.

عند إجراء وضع العلامات على EdU مع الخلايا المنقولة ببروتينات تحمل علامة GFP و RFP ، من الأهمية بمكان إخماد إشارات الفلورسنت من GFP و RFP. لتحقيق ذلك ، نضيف خطوة إضافية لتثبيت الخلايا بين عشية وضحاها باستخدام 70٪ من الإيثانول. في اليوم التالي ، بعد غسل الخلايا وتنفشها وفقا لبروتوكول النص ، أضف 0.5 مل من كوكتيل التفاعل في كل أنبوب واخلطه جيدا.

بعد الحضانة في الظلام وغسل آخر ، استخدم 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من يوديد البروبيديوم أو PI في 1٪ BSA PBS لتلطيخ الحمض النووي. قم بتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي لمتابعة السكان الإيجابيين ل EdU. قدم مخططا نقطيا متناثرا للخلايا المسماة EdU الملطخة بمحتوى الحمض النووي و EdU.

استخدم قناة APC ل Alexa 647 EdU باستخدام مرشح 670 30 نطاقا مع وجود كل الضوء ، وأقل من 685 نانومتر يصطدم بهذا المرشح وقناة phycoerythrin ل PI مع مرشح 581 15 نطاقا أمامه ، مع كل الضوء الموجود أقل من 600 نانومتر يضرب هذا المرشح. مع استراتيجية البوابات القياسية للاستحواذ ، قم برسم منطقة FSC بواسطة منطقة SSC للتشكل ، متبوعا ب PI بواسطة Alexa 647 EdU لتلوين الخلايا. سجل البيانات لجميع الأنابيب واحدا تلو الآخر ، واحصل على 10،000 حدث لكل عينة.

في هذا الشكل ، تم استخدام بروتين مصفوفة الميتوكوندريا Hsp60 وبروتين الفضاء بين الغشاء Timm13 كعلامات توطين الإرسال. على غرار Hsp60 ، ولكن على عكس Timm13 ، تم حماية cyclinB1 و Cdk1 من هضم التربسين ، مما يشير إلى أنهما يتوطنان في مصفوفة الميتوكوندريا. كما هو موضح هنا ، من خلال النشاف الغربي لكسور الميتوكوندريا المعزولة ، باستخدام تركيبات cyclinB1 و Cdk-1 الموسومة ب MTS و GFP ، تم تحقيق الإفراط في التعبير عن cyclinB1 و / أو Cdk-1 في الميتوكوندريا.

باستخدام مقايسة مطاردة النبض EdU ، تم إثبات أن خلايا الطور S المسماة تقدمت خلال مرحلة G2M وظهرت في مرحلة G1 في غضون 4 ساعات في الخلايا التي تعبر عن الميتوكوندريا من النوع البري cyclinB1 Cdk-1. بالمقارنة مع 6 ساعات ، في الخلايا التي تم نقلها باستخدام التحكم في النواقل أو cyclinB1 Cdk-1 المتحور ، مما يشير إلى أن تعزيز cyclinB1 Cdk-1 في الميتوكوندريا يسرع من تقدم دورة الخلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن قياس طرق أخرى مثل توليد ATP للميتوكوندريا ، واستهلاك الأكسجين ، وإمكانات الغشاء ، وأنواع الأكسجين التفاعلية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية توطين الميتوكوندريا لدورة الخلية كيناز Cdk-1 يغير تنفس الميتوكوندريا وإنتاج الطاقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة توطين الميتوكوندريا والوظائف الخاصة بالميتوكوندريا للكيناز النووي.