المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

الهدف العام من الإجراء التالي هو تحديد التموضع دون الميتوكوندري لبروتين كيناز دورة الخلية الذي يكون عادةً نووياً، ثم تحليل كيفية تأثير تموضعه الميتوكوندري على تقدم دورة الخلية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث الميتوكوندريا، مثل كيفية تواصل النواة مع الميتوكوندريا أثناء دورة الخلية. ومن خلال وسم البروتينات بتسلسل توجيه ميتوكوندري، يمكننا الاستفادة من التعبير المفرط المحدد للبروتين في الميتوكوندريا، مما يتيح لنا دراسة وظائفها النوعية داخل الميتوكوندريا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول استهداف بعض البروتينات للميتوكوندريا، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على العضيات الأخرى، مثل النواة، والشبكة الإندوبلازمية (ER)، وجهاز جولجي، والليزوسوم. بعد زراعة الخلايا وتجنيسها وترسيبها وفقاً لبروتوكول النص، انقل الطافي إلى أنبوب جديد. ثم قم بطرد العينة مركزياً عند 7,000 g و 4 degrees Celsius لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، استخدم 200 µL من محلول IBC المنظم المبرد بالثلج لإعادة تعليق الراسب، وقسم المتجانس إلى حصتين. قم بطرد العينات مركزياً مرة أخرى عند 7,000 g و 4 °C لمدة 10 دقائق. ثم كرر عملية الغسيل.

بعد التخلص من الطافي، أضف 30 µL من منظم تحليل الخلايا إلى إحدى الكريات، واحفظ المحلل عند 80 درجة مئوية لإجراء تحليل اللطخة المناعية. ولإجراء استخلاص بكربونات الصوديوم باستخدام الكرية الثانية لفصل البروتينات الذائبة والبروتينات المرتبطة بالغشاء، أضف 250 µL من كربونات الصوديوم بتركيز 0.1 molar ورقم هيدروجيني pH 11.0، ثم حضن العينة على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعدها، قم بالطرد المركزي عند 100,000 g لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، اجمع السائل الطافي وأضف حجماً مساوياً من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك بتركيز 20% المُحضر حديثاً لترسيب البروتينات. يحفظ على الثلج لمدة 30 دقيقة. وفي هذه الأثناء، أضف 30 µL من منظم تحلل الخلايا إلى الراسب وقم بعملية السونكة وفقاً للبروتوكول المكتوب قبل الحفظ في درجة حرارة 80 درجة مئوية من أجل تحليل اللطخة المناعية.

بعد تحضين TCA لمدة 30 دقيقة، قم بطرد مركزي للتفاعل عند 15,000 g لمدة 10 دقائق. تخلص من الطافي، ثم استخدم 80 µL من محلول التحلل الخلوي لإعادة تعليق الراسب. بعد عزل الكسور الميتوكوندرية من الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بتقسيم الكسور الميتوكوندرية إلى 10 حصص متساوية.

قم بترسيب العينات عند 7,000 g ودرجة حرارة 4 degrees Celsius لمدة 10 دقائق. استخدم 30 microliters من مجموعة تركيزات من محاليل سكر السكروز المنظمة ناقصة التوتر مع أو بدون trypsin لإذابة كل راسب. ثم قم بالتحضين على الثلج لمدة 30 دقيقة.

أضف 3 µL من PMSF بتركيز 10 mM إلى الأنابيب التي تحتوي على التربسين لإيقاف عملية الهضم بالتربسين. ثم حضن العينات على الثلج لمدة 10 دقائق. قم بطرد العينات مركزياً عند 14,000 g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.

ثم انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. ولتحليل الراسب، أضف 30 µL من محلول التحلل الخلوي (cell lysis buffer). قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية (sonication) للعينات كما هو موضح في البروتوكول النصي، واحفظها عند درجة حرارة 80 °C.

لإنشاء ناقلات cyclinB-1 Cdk-1 الموسومة بـ GFP/RFP والموجهة إلى الميتوكوندريا، قم باستنساخ تسلسل استهداف الميتوكوندريا من طليعة cytochrome-c oxidase subunit 8A البشري، وقم بتأطيره مع الطرف النيتروجيني (n-terminus) لـ GFP أو RFP عند موقعي Nhe1 و bAmH1 في pEGFP-N1 أو pERFP-N1، باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية. وباستخدام البادئات الموضحة في البروتوكول النصي، قم بتضخيم جيني Cdk1 و cyclinB1 باتباع التقنيات القياسية، ثم استخدم BamH1 لهضم نواتج تفاعل PCR.

قم بإجراء التفاعلات على هلام أغاروز بتركيز 1%، ثم استخدم شفرة حلاقة لقص قطع DNA ذات الحجم الصحيح. بعد ذلك، استخدم طقم استخلاص الهلام لتنقية DNA. بعد ذلك، قم بهضم ميكروجرام واحد من بلازميدات MTS-pEGFP-N1 و MTS-pERFP-N1 باستخدام 1 µL من BamH1 عند 37 °C لمدة ساعتين.

ثم أضف 1 µL من calf intestinal alkaline phosphatase واحضن المزيج عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. وبعد ترحيل نواتج الهضم على هلام agarose بنسبة 1% وتنقية الـ DNA كما وُصف سابقاً، قم بإعداد تفاعل ربط (ligation) باستخدام الكواشف المدرجة في البروتوكول النصي. ثم احضن التفاعل عند 4 °C طوال الليل.

قم بتحويل خلايا e. coli dH5-alpha المختصة باستخدام 10 µL من خليط الربط. ثم ازرع البكتيريا على أطباق LB agar مضافاً إليها 10 mg/mL من kanamycin عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، استخدم رأس ماصة معقم لالتقاط مستعمرة من الطبق، ثم أدخل الرأس في أنبوب يحتوي على 5 milliliters من LB kanamycin. قم بحضن المزرعة طوال الليل، وفي صباح اليوم التالي، استخدم مجموعة mini prep وفقاً لبروتوكول النص لعزل البلازميد.

لنقل البلازميدات إلى خلايا MCF-10A النامية أسيّاً، استخدم بلازميدات Cdk1 أو cyclinB-1 لتحضير كاشف نقل البلازميد بنسبة 1:2 في 100 µL من وسط خالٍ من المصل والمضادات الحيوية. قم بنقل البلازميدات إلى الخلايا واحضنها عند 37 °C لمدة 48 ساعة. قم بصبغ الميتوكوندريا وتصويرها وفقاً للبروتوكول المكتوب.

لإجراء فرز الخلايا، قم بدمج 2 × 10⁵ من الخلايا مع الناقلات المطلوبة في طبق ذو 6 آبار، باستخدام نسبة 1:2 من DNA إلى كاشف الدمج المحضر في 2.5 milliliters من وسط خالٍ من المصل والمضادات الحيوية. بعد تحضين عملية الدمج لمدة 48 ساعة، استخدم قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الحية التي تعبر بشكل مستقر عن بروتينات Cdk-1 الموسومة بـ GFP وبروتينات clyclinB1 الموسومة بـ RFP وفقاً للبروتوكول النصي. ولقياس طول الدورة الخلوية باستخدام مقايسة قياس التدفق الخلوي لوسم EdU، ازرع الخلايا المفرزة في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 2.5 × 10⁵ خلية لكل بئر.

بعد الحضانة طوال الليل، أضف EdU إلى وسط المزرعة بتركيز نهائي قدره 25 micromolar واحضنها لمدة ساعة إضافية. بعد ذلك، وعلى فترات زمنية كل ساعتين، استخدم 1%BSA في 500 microliters من PBS لغسل بئر واحد من الخلايا، ثم اجمعها في أنبوب سعة 1.5-milliliter.

قم بطرد الخلايا مركزياً عند 350 g لمدة 5 دقائق. ثم تخلص من السائل الطافي. قم بتفكيك الراسب بإضافة 100 microliters من محلول التثبيت.

امزج جيداً واترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، استخدم 1 milliliter من 1%BSA في PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات. ثم استخدم 0.5 milliliters من 70%ethanol لتثبيت الخلايا عند درجة حرارة 4 degrees Celsius طوال الليل.

عند إجراء وسم EdU للخلايا التي تم ترانسفكشنها ببروتينات موسومة بـ GFP و RFP، من الضروري إخماد الإشارات الفلورية الصادرة عن GFP و RFP. ولتحقيق ذلك، نضيف خطوة إضافية لتثبيت الخلايا طوال الليل باستخدام ethanol بتركيز 70%. وفي اليوم التالي، وبعد غسل الخلايا ونفاذيتها وفقاً للبروتوكول النصي، أضف 0.5 milliliters من كوكتيل التفاعل إلى كل أنبوب واخلط جيداً.

بعد الحضانة في الظلام وإجراء عملية غسل أخرى، استخدم 50 micrograms per milliliter من يوديد البروبيديوم أو PI في 1%BSA PBS لصبغ الـ DNA. قم بتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي لتتبع المجموعة الإيجابية لـ EdU. اعرض مخطط تشتت نقطي للخلايا الموصومة بـ EdU والمصبوغة لمحتوى الـ DNA و EdU.

استخدم قناة APC لـ Alexa 647 EdU باستخدام مرشح تمرير نطاق 670 30، بحيث يكون كل الضوء الساقط على هذا المرشح أقل من 685 nanometers، وقناة phycoerythrin لـ PI باستخدام مرشح تمرير نطاق 581 15 أمامه، بحيث يكون كل الضوء الساقط على هذا المرشح أقل من 600 nanometers. ومع اتباع استراتيجية تحديد بوابات قياسية للاستحواذ، قم برسم FSC area مقابل SSC area لدراسة المورفولوجيا، يليه رسم PI مقابل Alexa 647 EdU لصبغ الخلايا. قم بتسجيل البيانات لجميع الأنابيب واحدة تلو الأخرى، مع استحواذ 10,000 حدث لكل عينة.

في هذا الشكل، استُخدم بروتين مصفوفة الميتوكوندريا Hsp60 وبروتين الحيز بين الغشائي Timm13 كعلامات لتحديد التموضع داخل الميتوكوندريا. وعلى غرار Hsp60، وبخلاف Timm13، كانت بروتينات cyclinB1 وCdk1 محمية من الهضم بواسطة التربسين، مما يشير إلى تموضعها في مصفوفة الميتوكوندريا. وكما هو موضح هنا، من خلال تحليل لطخة وسترن لكسور الميتوكوندريا المعزولة، باستخدام بنيات cyclinB1 وCdk-1 الموسومة بـ MTS وGFP، تم تحقيق الإفراط في تعبير cyclinB1 و/أو Cdk-1 داخل الميتوكوندريا.

باستخدام مقايسة مطاردة نبض EdU، تم إثبات أن الخلايا المحددة في طور S قد انتقلت عبر طور G2M وظهرت في طور G1 في غضون 4 ساعات فقط في الخلايا التي تعبر عن mitochondrial cyclinB1 Cdk-1 من النوع البري. وبالمقارنة مع 6 ساعات في الخلايا التي تم ترنسفكشنها بناقل تحكم أو mutant cyclinB1 Cdk-1، فإن ذلك يشير إلى أن تعزيز mitochondrial cyclinB1 Cdk-1 يسرع من تقدم الدورة الخلوية. وعقب هذا الإجراء، يمكن قياس طرق أخرى مثل توليد ATP الميتوكوندري، واستهلاك الأكسجين، وجهد الغشاء، وأنواع الأكسجين التفاعلية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تأثير التموضع الميتوكوندري لـ kinase الدورة الخلوية Cdk-1 على التنفس الميتوكوندري وإنتاج الطاقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة التموضع الميتوكوندري والوظائف الخاصة بالميتوكوندريا لكيناز نووي.