تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور تكرار الحمض النووي على مستوى الجزيء الفردي. ابدأ بدمج نظائر النيوكليوتيدات المهلجنة في الحمض النووي المركب حديثا. في الخلايا الحية ، اكتشف الخلايا ذات الحمض النووي المسمى على المجهر.

انزلق الخلايا وقم بتمديد الحمض النووي على شريحة المجهر. يمكن أن يضيء التلوين المناعي اللاحق لألياف الحمض النووي وتحليل صور الفحص المجهري الفلوري ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل العالمية للسماح بالتحليل الكمي للمعلمات التي تؤثر على برنامج النسخ المتماثل الكلي. على مدى السنوات الماضية ، تم تطوير نسخة مختلفة من تقنيات فلور ألياف الحمض النووي لتصور حركة شوكة النسخ المتماثل الفردية داخل الخلايا الحية.

يمكن إنجاز هذه التجربة في الجسم الحي في خلايا DT 40 التي توشك على مشاهدتها في غضون يوم واحد ولا تتطلب سوى معدات مختبرية عامة ومجهر فلوري يوضح الإجراء ستكون الدكتورة ريبيكا شواب ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري. من أجل تسمية خلايا DT 40 في الجسم الحي ، ابدأ بثقافة تنمو بشكل كبير. أضف ملصق IDU إلى التركيز النهائي البالغ 25 ميكرومولار واخلط معلق الخلية.

احتضان الخلايا جيدا لمدة 20 دقيقة عند 38 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، أضف ملصق CLDU إلى التركيز النهائي البالغ 250 ميكرومولار. امزج واحتضن معلق الخلية.

الآن اغسل خلايا DT 40 باستخدام PBS reus المثلج. قم بتعليق كريات الخلية في PBS البارد واحتفظ بالخلايا المسماة على الجليد. ضع ميكرولترين من تعليق الخلية على أحد طرفي الشريحة الزجاجية حتى ينخفض حجم القطرة بشكل كبير ولكن لا يجف تماما.

الآن ، أضف سبعة ميكرولترات من محلول تحلل الألياف أعلى تعليق الخلية ، واخلط المحاليل برفق عن طريق التقليب باستخدام طرف ماصة لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإمالة الشرائح إلى 15 درجة للسماح للألياف بالانتشار على طول الشريحة. بمجرد وصول محلول الألياف إلى قاع الشريحة ، ضعه أفقيا حتى يجف في الهواء.

في هذه المرحلة ، يجب أن يكون هناك خط رفيع غير شفاف مرئي على طول الشريحة. ضع علامة على بداية الألياف الممتدة بقلم رصاص. أولا ، اغمر الشرائح في ثلاثة إلى واحد من الميثانول إلى حمض الأسيتيك لمدة 10 دقائق.

اغسل الشرائح بالماء المقطر ، ثم اغمرها في حمض الهيدروكلوريك 2.5 مولار لمدة 80 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. اجمع PBS الزائد على منشفة ورقية.

ثم قم بتوجيه الشرائح أفقيا. الآن قم بوضع ماصة 5٪ BSA في PBS أعلى كل شريحة ، ووضع غطاء زلة احتضان لمدة 20 دقيقة. حرك انزلاق الغطاء برفق لأسفل الشريحة الزجاجية.

قم بإزالة BSA الزائد بمنشفة ورقية. ثم ماصة 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية المضادة ل BRDU. على كل شريحة.

قم بتغطية اللعبة بزلة غطاء واحتضانها في غرفة رطبة لمدة ساعتين. بعد إزالة زلات الغطاء ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. ضع 50 ميكرولترا من زلات غطاء موضع محلول الجسم المضاد الثانوي ، وكذلك حماية الشرائح من الضوء.

ثم احتضن لمدة ساعة. قم بإزالة زلات الغطاء واغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. أخيرا ، أضف قطرة من وسيط تركيب الدرع المتجه على كل شريحة.

اضغط برفق على زلة الغطاء وقم بإزالة السوائل الزائدة حولها. باستخدام منشفة ورقية ، أغلق زلات الغطاء بطلاء أظافر شفاف وجففها في الهواء. قم بتخزين الشرائح عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

ضع قطرة من زيت الغمر على شريحة قريبة من علامة القلم الرصاص وابدأ في تحديد موقع الألياف. ابتعد عن الحزمة الرئيسية للعثور على المناطق التي يتم فيها فصل الألياف بوضوح عن بعضها البعض. في تجربة نموذجية، حدد الصور باستخدام قناة ألوان واحدة فقط لتجنب التحيز.

ثم التقط ما يقرب من 10 صور لكل عينة. تحرك على طول الشريحة لالتقاط صور مختلفة حيث قد لا توفر منطقة واحدة من الشريحة أطوال ألياف تمثيلية أو هياكل النسخ المتماثل. استيراد الصور إلى برنامج تحليل الصور.

قم بقياس أطوال 100 مسلك ألياف أو عد 150 إلى 200 هيكل نسخ متماثل مختلف. تسمح تقنية ألياف الملصقات المزدوجة للمرء بالتمييز بين هياكل النسخ المتماثل المختلفة. يمكن تصور الحمض النووي المكرر حديثا كخطوط من نظائر النيوكليوتيدات المسماة بالأجسام المضادة.

هنا ، يتم تمثيل شوكة استطالة مستمرة كإشارات حمراء وخضراء متجاورة. يمكن تقسيم أحداث البدء الجديدة إلى أصول تم إطلاقها أثناء احتضان الخلايا بالملصق الأول والأصول التي تم إطلاقها أثناء الحضانة باستخدام التسمية الثانية. يتكون الأول من إشارات خضراء وحمراء خضراء مجاورة والأخيرة من خط أخضر. فقط.

تظهر أحداث الإنهاء على أنها خضراء حمراء مجاورة. تتخللها إشارات حمراء. تتكون الأصول من أصول متتالية وإشارات إنهاء.

اعتمادا على التصميم التجريبي ، يمكن تعريف الشوكات المتوقفة أو المنهارة على أنها إشارة حمراء فقط أو خط أحمر ، متبوعا بمسار أخضر قصير. في هذه التجربة ، يبلغ متوسط سرعة شوكة الخلايا DT 40 من النوع البري 0.4 ميكرون في الدقيقة. مع 63٪ شوكات مستمرة ، 10٪ أصول ، 16٪ شوكات متوقفة ، 8٪ إنهاء ، و 3٪ ألياف متناثرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وتحليل ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل في خلايا DT 40. سيوفر لك هذا أداة أساسية للتحقيق في عيوب تكرار الحمض النووي.