تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور تضاعف DNA على مستوى الجزيء الواحد. ابدأ بدمج نظائر النوكليوتيدات المهلجنة في DNA المُصنّع حديثاً. وفي الخلايا الحية، يتم وضع الخلايا التي تحتوي على DNA مُوسوم على المجهر.

يتم بعد ذلك وضع الخلايا على الشريحة وبسط الحمض النووي DNA على شريحة المجهر. ويمكن أن يؤدي الصبغ المناعي اللاحق لألياف DNA وتحليل صور المجهر الفلوري إلى توضيح ديناميكيات شوكة التضاعف الشاملة، مما يسمح بالتحليل الكمي للمعلمات التي تؤثر على برنامج التضاعف العام. وعلى مدار السنوات الماضية، تم تطوير إصدارات مختلفة من تقنيات ألياف DNA الفلورية لتصور حركة شوكة تضاعف فردية داخل الخلايا الحية.

يمكن إنجاز هذه التجربة التي ستشاهدونها الآن على خلايا DT 40 في الجسم الحي (in vivo) في غضون يوم واحد، وهي لا تتطلب سوى معدات مختبرية عامة ومجهر فلوري، وستقوم الدكتورة ريبيكا شواب، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح الإجراء. من أجل وسم خلايا DT 40 في الجسم الحي، ابدأ بمزرعة في مرحلة النمو الأسي. أضف وسم IDU ليصل إلى تركيز نهائي قدره 25 micromolar ثم اخلط معلق الخلايا.

يتم تحضين الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 38 °C و 5% carbon dioxide. بعد ذلك، يُضاف وسم CLDU ليصل إلى تركيز نهائي قدره 250 micromolar. يُمزج معلق الخلايا ثم يُحضن.

اغسل الآن خلايا DT 40 بمحلول PBS بارد جداً. قم بتعليق كتل الخلايا في محلول PBS بارد وحافظ على الخلايا الموصومة على الثلج. ضع ميكرولترين من معلق الخلايا على أحد طرفي الشريحة الزجاجية واتركها لتجف في الهواء حتى ينخفض حجم القطرة بشكل كبير ولكن دون أن تجف تماماً.

الآن، أضف 7 µL من محلول تحلل الألياف فوق معلق الخلايا، وامزج المحاليل برفق عن طريق التحريك بطرف الماصة ثم حضّن المزيج لمدة دقيقتين. بعد ذلك، أمل الشرائح بزاوية 15 درجة للسماح للألياف بالانتشار على طول الشريحة. وبمجرد أن يصل محلول الألياف إلى أسفل الشريحة، ضعها بشكل أفقي لتجف في الهواء.

في هذه المرحلة، يجب أن يظهر خط رقيق معتم على طول الشريحة. حدد بداية الألياف الممدودة باستخدام قلم رصاص. ابدأ بغمر الشرائح في محلول من الميثانول وحمض الأسيتيك بنسبة 3:1 لمدة 10 دقائق.

اغسل الشرائح بالماء المقطر، ثم اغمرها في حمض الهيدروكلوريك بتركيز 2.5 molar لمدة 80 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق، ثم جففها بالتربيت. اجمع فائض PBS باستخدام منشفة ورقية.

بعد ذلك، قم بتوجيه الشرائح أفقيًا. الآن، استخدم الماصة لوضع 5%BSA في PBS فوق كل شريحة، ثم ضع غطاء الشريحة واتركها لتحضن لمدة 20 دقيقة. حرك غطاء الشريحة بلطف إلى أسفل الشريحة الزجاجية.

قم بإزالة الـ BSA الزائد باستخدام مناديل ورقية. بعد ذلك، انقل 50 µL من محلول الجسم المضاد الأولي anti BRDU باستخدام الماصة إلى كل شريحة.

قم بتغطية العينة بغطاء شريحة وحضنها في غرفة رطبة لمدة ساعتين. بعد إزالة أغطية الشرائح، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. ضع 50 µL من محلول الجسم المضاد الثانوي، ثم ضع أغطية الشرائح، واحفظ الشرائح بعيداً عن الضوء.

بعد ذلك، يتم التحضين لمدة ساعة واحدة. تُزال شرائح التغطية وتُغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. وأخيراً، تُضاف قطرة من وسط التثبيت vector shield على كل شريحة.

اضغط برفق على غطاء الشريحة وأزل السائل الزائد من حوله. وباستخدام مناديل ورقية، قم بإغلاق حواف أغطية الشرائح بطلاء أظافر شفاف واتركها لتجف في الهواء. تُحفظ الشرائح عند درجة حرارة -20 °C.

ضع قطرة من زيت الغمر على الشريحة بالقرب من علامة القلم الرصاص وابدأ في تحديد موقع الألياف. تحرك بعيداً عن الحزمة الرئيسية للعثور على مناطق تكون فيها الألياف منفصلة بوضوح عن بعضها البعض. في التجربة النموذجية، اختر الصور باستخدام قناة لونية واحدة فقط لتجنب الانحياز.

بعد ذلك، يتم التقاط 10 صور تقريبًا لكل عينة. يتم التحرك على طول الشريحة لالتقاط صور مختلفة، حيث إن منطقة واحدة من الشريحة قد لا توفر أطوال ألياف ممثلة أو هياكل تكرارية. يتم استيراد الصور إلى برنامج لتحليل الصور.

قم بقياس أطوال الـ 100 حزمة ليفية أو عد 150 إلى 200 هيكل تضاعف مختلف. تسمح تقنية الوسم المزدوج للألياف بالتمييز بين هياكل التضاعف المختلفة. ويمكن تصور الحمض النووي DNA المتضاعف حديثاً على شكل خطوط من نظائر النيوكليوتيدات الموسومة بالأجسام المضادة.

هنا، يتم تمثيل شوكة استطالة مستمرة على شكل إشارات حمراء وخضراء متجاورة. ويمكن تقسيم أحداث البدء الجديدة إلى نقاط أصل قد تم تنشيطها أثناء حضانة الخلايا مع العلامة الأولى ونقاط أصل تنشطت أثناء الحضانة مع العلامة الثانية. وتتكون الأولى من إشارات خضراء وحمراء خضراء متجاورة، بينما تتكون الأخيرة من خط أخضر فقط.

تظهر أحداث الإنهاء على شكل لونين أحمر وأخضر متجاورين. وتكون الإشارات الحمراء متفرقة. وتتكون نقاط الأصل من نقاط أصل وإشارات إنهاء متتالية.

اعتماداً على التصميم التجريبي، يمكن تعريف الشوكات المتوقفة أو المنهارة إما بأنها إشارة حمراء فقط أو خط أحمر تتبعه مسافة خضراء قصيرة. في هذه التجربة، تمتلك خلايا DT 40 من النوع البري متوسط سرعة شوكة يبلغ 0.4 microns per minute. مع وجود 63% من الشوكات المستمرة، و10% من نقاط الأصل، و16% من الشوكات المتوقفة، و8% من عمليات الإنهاء، و3% من الألياف المتداخلة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وتحليل ديناميكيات شوكة التضاعف في خلايا DT 40. سيوفر لك ذلك أداة أساسية للبحث في عيوب تضاعف DNA.