الفصل القائم على الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة لنيوكليوتيدات (p) ppGpp المعزولة من البكتيريا التي تسببها الإجهاد

ابدأ بمستخلصات النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية التي تم الحصول عليها من مزرعة بكتيرية قبل وبعد تحريض الإجهاد.

تحت الضغط ، تقوم الإنزيمات البكتيرية بتحويل ثلاثي فوسفات الغوانوزين وثنائي فوسفات غوانوزين إلى نيوكليوتيدات غوانوزين خماسي فوسفات وغوانوزين رباعي فوسفات.

ضع المستخلصات على صفيحة كروماتوغرافيا رقيقة الطبقة مطلية مسبقا ببوليمر كاتيوني كمرحلة ثابتة.

ضع اللوحة في غرفة تحتوي على مخزن مؤقت كمرحلة متحركة ، مع التأكد من بقاء السائل أسفل البقعة لمنع الانتشار المبكر.

اسمح للمخزن المؤقت بالصعود عن طريق العمل الشعري ، وفصل النيوكليوتيدات سالبة الشحنة إلى نطاقات مميزة بناء على شحنتها وحجمها.

بعد التطوير ، قم بإزالة اللوحة وتجفيفها في الهواء وتقليم الجزء العلوي للتخلص من النظائر الحرة وتقليل إشارة الخلفية.

قم بتعريض اللوحة لشاشة حساسة للإشعاع لاكتشاف الإشارة المشعة.

تكشف المستويات المتزايدة من رباعي فوسفات غوانوزين وخماسي فوسفات غوانوزين بعد تحريض الإجهاد عن تحولات ديناميكية في تجمع نيوكليوتيدات غوانوزين.

أولا ، قم بتعيين لوحة 20 × 20 سم PEI السليلوز TLC.

استخدم المقص لإزالة أعلى خمسة سنتيمترات ، واستخدم قلم رصاص ناعم لتحديد خط الأصل على بعد سنتيمتر واحد من الحافة. ضع قطرة خمسة ميكرولتر من كل عينة على سطح جزيرة الأمير إدوارد.

قبل أن تجف البقعة ، انقل اللوحة إلى خزان يحتوي على طبقة من فوسفات أحادي البوتاسيوم 1.5 مولار ضحلة بدرجة كافية بحيث لا تلمس بقعة العينة الأصلية. قم بتغطية الخزان بختم محكم الغلق ، واسمح للسائل بالصعود إلى أعلى الصفيحة المشذبة التي يبلغ طولها 15 سم. بعد ذلك ، قم بإزالة مخطط الكروماتوج المطور بالكامل وجففه في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

قم بقص وتخلص من الجزء العلوي من الكروماتوغرام الذي يحتوي على P32 الحر في نفايات مشعة. استخدم شاشة فوسفورية لكشف الأفلام السمعية الإشعاعية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتطوير الفيلم واستخدم جهاز تصوير الفوسفور لالتقاط الإشارة الخضراء للفوسفور وقياسها.

بعد ذلك ، استخدم برنامج ImageJ لقياس البقع المشعة.