عزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليل التركيبي بواسطة الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائلة

يتكون جدار الخلية البكتيرية من الببتيدوكليكان، وهي شبكة من الخلايا الجزيئية الكلية من خيوط السكر التي يرتبط بها الببتيدات. الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائل يوفر دقة عالية والإنتاجية لاكتشافات جديدة من تكوين peptidoglycan. نقدم إجراء لعزل جدران الخلايا (sacculi) وإعدادها للتحليل لاحقا عبر UPLC.

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وهضم جدران الخلايا البكتيرية لتحديد الهويات والكسور النسبية للببتيدات العصبية المختلفة. باستخدام تحليل UPLC ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تحلل العينات البكتيرية أولا عن طريق الغليان في كبريتات الصوديوم. بعد غسل SDS ، فإن الخطوة الثانية هي هضم العينات باستخدام البروناز E لتنقية الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام.

بعد ذلك ، يتم هضم العينات مع المازة لإذابة الببتيدوغليكان إلى ببتيدات عصبية فردية. الخطوة الأخيرة هي تقليل الببتيدات العصبية وضبط الأس الهيدروجيني على النقطة المتساوية الكهربية للببتيد العصبي. في النهاية ، يتم استخدام UPLC لفصل الببتيدات العصبية وفقا للحجم والكراهية للماء ، مما يسهل القياس الكمي لخصائص جدار الخلية المهمة ، مثل درجة الارتباط المتقاطع ومتوسط طول خيط الجليكان.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن إجابات الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة ، مثل العلاقات بين التشكل ، وبنية جدار الخلية ، وتنشيط الجهاز المناعي ، والتسبب في المرض. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تطويرها لتنقية الببتيديل جلاكان سالب الجرام ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها على البكتيريا موجبة الجرام مع إضافة عدد قليل من الإنزيمات والعلاجات الكيميائية لزراعة الثقافات البكتيرية مرة أخرى ، قم بتخفيف الثقافات بين عشية وضحاها من واحد إلى 100 إلى 250 مل من الوسائط الطازجة وتنمو إلى الكثافة البصرية المطلوبة عند 600 نانومتر أثناء نمو الثقافات المخففة. قم بإعداد حمام مائي مغلي على طبق ساخن في دورق سعة لتر واحد.

بمجرد غليان الماء ، قم بتقطيع ستة ملليلتر من كبريتات ديل الصوديوم بنسبة 6٪ أو SDS في أنابيب بولي بروبيلين سعة 50 مل. أضف قضيب تقليب صغير إلى كل أنبوب وشد إصبعك أغطية الأنبوب بإحكام. ضع الأنابيب في حمام الماء المغلي وحركه بسرعة 500 دورة في الدقيقة على اللوح الساخن.

احصد 250 مليلتر من المزارع عن طريق الغزل عند 5،000 مرة جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الكريات في ثلاثة ملليلتر من الوسائط أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات. قم ببسط معلقات الخلية ببطء في أنابيب سعة 50 مليلتر مع 6٪ من SDS المغلي لقمل الخلايا أثناء غمر الأنابيب في حمام الماء المغلي وإعادة إغلاق الأغطية بإحكام الإصبع.

قم بتغطية حمام الماء المغلي واترك الخلايا تغلي لمدة ثلاث ساعات ، وتحقق من مستوى الماء بشكل دوري وأعد ملء الحمام المائي عند الضرورة. بعد ثلاث ساعات ، أطفئي النار على الطبق الساخن واستمري في التقليب طوال الليل بسرعة 500 دورة في الدقيقة. إذا ترسب SDS في أنابيب سعة 50 مليلتر طوال الليل ، فاضبط الحمام المائي على الغليان لمدة ساعة إلى ساعتين إضافيتين.

يظهر هنا كيف يجب أن تبدو الثقافة العادية بعد التحلل بين عشية وضحاها. في SDS ، لاحظ الشفافية بدلا من التعتيم الذي يرتبط بهطول الأمطار. قم بإعداد المخزن المؤقت للانبطاح وتنشيط E عند 60 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة 30 دقيقة على الأقل.

استخدم جهاز طرد مركزي فائق ضبط على 400 ، 000 مرة G لتدوير العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل تكوير جزيئات البيبتول جليكان الكبيرة أو جزيئات PG الكبيرة وبالتالي تنقيتها من المكونات الخلوية الأخرى. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ثم أعد تعليق كل حبيبات في درجة حرارة الغرفة. يعتمد حجم تعليق مقاومة الماء عالي النقاء على حجم أنابيب الطرد المركزي الفائقة المستخدمة.

استخدم حجما يملأ الأنابيب في منتصف الطريق على الأقل ، ولكن لا يتجاوز الحد الأقصى لحجم الأنابيب. كرر الطرد المركزي والغسيل حتى لا يشكل الماء فقاعات أثناء تعليق Resus مما يشير إلى إزالة SDS بالكامل في هذه المرحلة. يقوم Resus بتعليق العينات في 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت tris HCL ونقله إلى أنبوبين مليلترين تم ثقبهما مسبقا بثقوب في القمم.

باستخدام إبرة صغيرة ، أضف 100 ميكرولتر من البروناز E المنشط إلى كل عينة قبل الحضانة عند 60 درجة مئوية لمدة ساعتين. أوقف عسر الهضم المعرض عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 6٪ SDS إلى كل عينة وغلي العينات في كتلة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. كما كان من قبل ، استخدم جهاز طرد مركزي فائق ضبط على 400 ، 000 مرة G لتدوير العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وغسلها بماء فائق النقاء بدرجة حرارة الغرفة حتى تتم إزالة SDS بالكامل في آخر خطوة غسيل بالطرد المركزي ، وتعليق العينات في 200 ميكرولتر من 50 مللي مولار من فوسفات الصوديوم.

يمكن تعديل هذا الحجم وفقا لكمية Pepto glycan في العينة وقد يعتمد على الأنواع. إذا كانت العينة تحتوي على المزيد من بيب جليكان ، فقم بزيادة حجم التعليق. إذا كانت العينة تحتوي على القليل من الببتيد جليكان.

قلل حجم تعليق resus إلى 50 ميكرولتر كحد أدنى. انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مليلتر وأضف ملليغراما واحدا لكل مليلتر لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 40 ميكروغراما لكل مليلتر. احتضن لمدة ست إلى ثماني ساعات أو طوال الليل في كتلة حرارية 37 درجة مئوية.

لتحضير عينات ل UPLC ، قم بتشغيل كتلة حرارية إلى 100 درجة مئوية. قم بغلي العينات بدون SDS لمدة خمس دقائق لإيقاف عينات الطرد المركزي لهضم الميس لمدة 10 دقائق عند 16،000 مرة. G في درجة حرارة الغرفة.

الببتيدات العصبية موجودة الآن في المادة الطافية. انقل المادة الطافية إلى أنابيب زجاجية مقاس 13 × 100 ملم. حاول استعادة أكبر قدر ممكن من المادة الطفية ، والاقتراب جدا من الحنك دون إزعاجه.

اضبط الأس الهيدروجيني عن طريق إضافة 500 مللي مولار من المخزن المؤقت للبورات إلى العينة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 مللي مولار من البورات العازلة ثمانية متوافق مع عامل الاختزال. يضيف هيدريد بورو الصوديوم عدة حبيبات من هيدريد بورو الصوديوم لتقليل كل عينة والسماح للتفاعل بالاستمرار لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اضبط العينات على درجة الحموضة ستة كما تم قياسها باستخدام ورق مؤشر الأس الهيدروجيني مع حمض الفوسفوريك الأورثومي باستخدام زيادات قدرها 20 ميكرولتر ، يجب أن تغلي العينة استجابة لإضافة حمض الفوسفوريك الأورثو.

تتوقف العينة عادة عن الفقاعات عند الوصول إلى درجة حموضة ستة. ثم استمر في ضبط العينات على ما بين درجة الحموضة ثلاثة وأربعة باستخدام حمض الفوسفوريك الأورثومي باستخدام زيادتين ميكروليلتر. قم بتصفية العينة من خلال حقنة 0.22 ميكرون.

قم بالتصفية مباشرة في قارورة A-U-P-L-C. إذا تم إصلاح الراسب في العينات بمجرد نقلها إلى قوارير UPLC ، فقم بتسخين القوارير بعدة تمريرات عبر اللهب. ضع قارورة UPLC في جهاز أخذ العينات التلقائي وقم بحقن 10 ميكرولتر من كل عينة على أداة A-U-P-L-C.

مجهزة بعمود UPLC معكوس C 18 وكاشف امتصاص محدد للمراقبة. يتم حقن عينات من 202 إلى 208 نانومتر بالتتابع. اضبط التدفق على 0.25 مل في الدقيقة واستخدم تدرجا خطيا على مدار 25 دقيقة لتحقيق 100٪ مذيب B و E تسلسلي من الببتيدات العصبية في غضون 30 دقيقة.

إذا تم استخدام قياس الطيف الكتلي لتوصيف الببتيدات العصبية بعد UPLC ، فقم بتجميع كسور من ذروة الاهتمام في مجمع الكسر ، ونقل الكسور إلى أنبوب 1.5 مليلتر ثم تجفيف الكسور باستخدام كسور مبخر الطرد المركزي ، فيجب تحلية الكسور قبل تحليل MS. في نتيجة UPLC النموذجية هذه. يحدد الكشف عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 202 إلى 208 نانومتر كدالة للوقت وقتا معينا للاحتفاظ بالببتيدات العصبية.

لوحظ دقة واضحة بين معظم أنواع الببتيد العصبي وقوة إشارة قوية عبر الطيف ، مما يتيح تحليل درجة متوسط طول خيط الجليكان المتداخل وهوية الببتيدات العصبية وتركيزاتها. يظهر هنا مثال على الكروماتوجرام الذي يعكس ترسيب C للببتيدات العصبية. لم يتم التلميح إلى أي قمم مما أدى إلى عدم وجود أي بيانات حول تكوين PG.

يمكن أن يحدث عدم وجود قمم ملحوظة من تحليل UPLC نتيجة التركيز الفائق للعينة أو سوء ضبط الأس الهيدروجيني إلى أقل بكثير من النقطة المتساوية للببتيدات العصبية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاثة أيام ، وإن كانت محمومة ، فقد تم أداؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل قياس الطيف الكتلي لتحديد أنواع الببتيد العصبي بشكل إيجابي بناء على الكتلة بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف الوظيفة الكيميائية الحيوية لإنزيمات جدار الخلية الرئيسية وطريقة عمل المثبطات الكيميائية في مجموعة متنوعة من الأنواع والطفرات.