تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

العام من الإجراء التالي هو إظهار كيف أن تطبيع بنية الخلية والموضع الذي تم تحقيقه على أنماط دقيقة لاصقة محددة يسمح بأتمتة سهلة للحصول على الصور ومعالجة الصور المباشرة مع القياس الكمي الحساس والقوي لتأثيرات الدواء ، وهو أمر لا يمكن تحقيقه على دعامات انزلاق الغطاء الزجاجي التقليدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع خلايا طائرات الهليكوبتر على رقاقتين في SI تحمل ثلاثة أنماط دقيقة على شكل حرف L. تتبنى الخلايا الشكل الثلاثي لبناء ألياف إجهاد رئيسية تمتد على طرفي L.يتم تحضين خلايا النمط بعد ذلك باستخدام lebos ستاتين أو تركها دون علاج ، ثم يتم تثبيتها وتلطيخها لتصور الهيكل الخلوي والنوى الأكتونية.

ثم يتم الحصول على صور خلايا النمط المصغر ومعالجتها باستخدام ماكرو مرجع الخلية لإنشاء كومة من الصور للتحليل وماكرو الوتر لتحديد الأنماط الظاهرية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تأثيرا كبيرا للجرعات المنخفضة من الستاتين BLEs على خلايا HELOC الدقيقة ، والتي لا يمكن اكتشافها في ظروف زراعة الخلايا القياسية. مرحبا ، أهلا بك.

نحن هنا اليوم لنطلعك على بروتوكولنا التجريبي الذي يشرح كيفية استخدام الأنماط الدقيقة اللاصقة لتحليل الخلايا بالإضافة إلى عرض البيانات التجريبية التي توضح سهولة القياس الكمي لجرعات منخفضة جدا من الأدوية على هذه الأنماط الدقيقة اللاصقة. لذلك عند رؤية هذه الأنماط الدقيقة لأول مرة ، ستفهم على الفور كيف يمكنها حل مشكلات التباين في التقاط الصور أثناء تحليل الخلية. لأنه من خلال وجود مجموعة من الخلايا حقا ، مثل المصفوفة الدقيقة ، يمكنك بسهولة نقل مرحلة المجهر من خلية إلى أخرى لتتمكن من التقاط الصور بطريقة تدريجية.

لكن هذه بالطبع ليست الميزة الوحيدة للأنماط الدقيقة التي تقدمها. إنه يقدم المزيد من التحسينات لأنه في الواقع ، في بعض الأنماط الدقيقة النموذجية مثل crossbo أو Y ، نقوم في الواقع بتطبيع بنية الخلية الداخلية ، مما يعني أن العضيات ، والمغزل الانقسامي ، والهيكل الخلوي وشبكات البروتين المختلفة كلها في نفس المواقع من خلية إلى أخرى أو في نفس الاتجاه من خلية إلى أخرى ، مما يجعل من الأسهل بكثير التنبؤ بآثار الأدوية وتحديدها على هذه الأنماط المعينة. الآن قد يبدو هذا غير بديهي تماما مما يتم القيام به عادة في طبق بتري الكلاسيكي أو الصفيحة الدقيقة.

حسنا ، لأنك غالبا ما ترى بالطبع ، الخلايا تتحرك وتتبنى أشكال مختلفة. بينما في الأنماط الدقيقة اللاصقة ، ستبدأ جميع الخلايا في الظهور متشابهة لأنها تستجيب لهذا النمط الجزئي اللاصق وتنظم بنيتها بنفس الطريقة. قد يبدو هذا في الواقع مصطنعا بعض الشيء ، ولكن عندما تنظر إليه عن كثب ، أليس طبق بتري أكثر اصطناعية؟

لأنه في الأنسجة ، يتم تقييد الخلايا بالخلايا المجاورة وكذلك بالمصفوفة خارج الخلية. لدرجة أنهم يتلقون الكثير من المعلومات المكانية ، والتي توجه بنية الخلية. وهذا في الموقع للإعلان عن الأنماط الدقيقة هو ما نقوم به.

نحن نعيد هذه المعلومات المكانية إلى الخلايا وجميع الخلايا تستجيب لذلك وتنظم بنفس الطريقة. والآن نظرا لأن جميع الخلايا متشابهة ، يمكننا تقديم مفهوم الخلية المرجعية ، مما يعني أنه يمكننا حساب متوسط جميع الصور والحصول على صورة واحدة ، والتي تمثل حقا شكل الخلية في حالة معينة. ثم يمكنك إضافة دواء وإلقاء نظرة مرة أخرى على تلك الخلية المرجعية ومعرفة كيف عدلت مورفولوجيا الخلية أو تنظيمها استجابة لهذا الدواء.

ضع شريحتين في الموقع بشكل فردي في بئرين مستقلين من ستة آبار ، مما يضمن أن الشعار في الموقع اثنين قابل للقراءة. تحتوي الرقيحتان الموقعتان المستخدمتان في هذه التجربة على أنماط دقيقة ملطخة ب FibroGen SI three ويجب الاحتفاظ بها في الظلام قبل الاستخدام. اجمع خلايا hela التي تتلاقى حوالي 80٪ بواسطة التربسين وتحقق من أنها فردية بشكل صحيح تحت جهاز طرد مركزي مجهر عند 300 جم لمدة أربع دقائق وقم بتعليق الخلايا برفق وعد الخلايا وتخفيفها إلى تركيز 15،000 خلية لكل مليلتر.

في وسائط الثقافة غير المكتملة D-M-E-M-F 12 توزع 60،000 خلية لكل بئر. يجب تحريك اللوحة بأقل قدر ممكن لتجنب إدخال حركات دوارة في الوسط ، والتي تميل إلى تركيز الخلايا في المركز. اسمح للخلايا بالترسيب لمدة 10 دقائق تحت الغطاء ، ثم انقلها إلى حاضنة الخلية.

في غضون 10 إلى 20 دقيقة في حاضنة الخلية ، ستبدأ الخلايا في الالتصاق بعد 10 دقائق ، وتحقق بانتظام تحت المجهر عند التصاق الخلايا. قم بتغيير وسط الخلية وإزالة الخلية الزائدة عن طريق تكرار الإجراء التالي أربع مرات. الحفاظ على اللوحة مسطحة ، قم بشفط الوسط برفق من جانب البئر.

احرص على الاحتفاظ بوسائط كافية لتجنب جفاف الشريحة. أضف أربعة ملليلتر من PBS والشفيق بدءا من مركز الشريحة. ثم انتقل إلى جانب البئر لشفط معظم PBS كما كان من قبل ، تحقق تحت المجهر بحثا عن الخلايا العائمة.

إذا بقيت كمية كبيرة من الخلايا العائمة ، كرر إجراء الغسيل. في حالة وجود عدد قليل جدا من الخلايا ، استنشق جزءا من PBS واستبدله بملليلترين من الشفط المتوسط الطازج وأضف أربعة ملليلتر من الوسط الطازج مرتين. احتضان الخلايا لمدة ثلاث ساعات في حاضنة خلية للسماح للخلايا بالانتشار الكامل.

باستخدام هذه الطريقة ، ستشغل خلية واحدة ما بين 10 و 30٪ من الأنماط الدقيقة ، في حين أن الأنماط الأخرى ستكون إما فارغة أو مشغولة بخلايا متعددة. لعلاج الخلايا باستخدام BLEs ، قم بتخفيف محلول مخزون الدواء 17 ملليمولار إلى تركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار مع 0.1٪ DMSO في أربعة ملليلتر من المتوسط. للتحكم ، قم بإعداد الوسط بنسبة 0.1٪ DMSO فقط ، قم بشفط وسط الخلية واستبدله بسرعة ب BLEs أو الستاتين أو محاليل التحكم لتجنب جفاف الرقاقة.

احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد عازلة الهيكل الخلوي. أضف غراما واحدا من السكروز إلى ملليلترين من cb.

هذا يساعد في الحفاظ على هياكل الخلايا الداخلية. امزج ملليلتر واحد من السكروز CB مع أربعة ملليلتر من 5٪ PFA. أضف ملليلترين من PFA في محلول السكروز CB.

في بئرين من ستة بئر طازجة. لإصلاح الخلايا ، استخدم الملقط لالتقاط شريحة CY الثانية ووضعها في صفيحة الآبار الستة التي تحتوي على ملليلترين من PFA في محلول السكروز CB. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة PFA وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم اغسل الخلايا بملليلترين من 100 مللي مولار كلوريد الأمونيوم لمدة 10 دقائق.

لإخماد نشاط الربط المتقاطع المتبقي ل PFA ، قم باختراق الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من PBS تحتوي على 0.1٪ tritton X 100 لمدة ثلاث دقائق ، وغسلها مرتين باستخدام خيوط الأكتين PBS مع ملليلترين من ZI المترافق في واحد إلى 2000 في PBS مع 1.5٪ احتضان BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ملليلترين من PBS. بعد ذلك ، حافظ على النوى.

أضف ملليلترين من ملليغرام واحد لكل مليلتر يتم بيعه في PBS واحتضانه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل مرتين بملليلترين من PBS. قم بتركيب شريحتين جانبيتين على شريحة قياسية باستخدام 25 إلى 30 ميكرولترا من محاليل التركيب مثل al.

للحصول على صور بثلاثة أطوال موجية ، نستخدم برنامج تصوير Metamorph ومجهر NIK eclipse T. مجهزة بكاميرا CCD Hema Matsu وإضاءة ألياف الزئبق الخفيفة المكثفة. حدد أولا 20 × تكبير.

بعد ذلك في شريط القائمة ، افتح الاستحواذ متعدد الأبعاد. لإعداد المعلمات المختلفة للتجربة. حدد أولا مكان حفظ بياناتك.

اضبط عدد الأطوال الموجية على ثلاثة ، وحدد الطول الموجي الثلاثة للنظام الدولي للوحدات وضع شريحة انزلاق الغطاء بحيث يتم توسيط 12 نمطا صغيرا في حقل الكاميرا. سيختلف عدد الأنماط الدقيقة المرئية لكل حقل وفقا للكاميرا وإعدادات الهدف. اضبط وقت التعرض لكل طول موجي وتركيز تلقائي.

بالنسبة إلى PS three ، قم بإنشاء دفتر يوميات يقوم بتشغيل الاستحواذ متعدد الأبعاد واحفظه ك MDA jnl. افتح وظيفة مرحلة المسح للحصول على 24 صورة تحتوي كل منها على 12 نمطا دقيقا. أدخل ستة أعمدة وأربعة صفوف بحجم خطوة ناقص 400 ميكرون × ، وحجم خطوة 300 ميكرون y في دفتر اليومية المحدد للتنفيذ ، وقم بتحميل المسح الضوئي للصحافة MDA jnl لبدء الاستحواذ الآلي على 24 صورة في الأطوال الموجية الثلاثة.

في هذا الفيديو ، يتم استخدام أنماط L الدقيقة لتحفيز تكوين ألياف إجهاد أكتين رئيسية واحدة تدعم الجزء غير المتصل من الخلية وتبسيط تصور وقياس تأثير الستاتين BLEs على الخلايا مقارنة بالخلايا الموجودة على فيبرونكتين عادي. لمعالجة الصور وتحليلها الآلي ، نحدد اثنين من وحدات الماكرو المخصصة المكتوبة لصورة البرنامج مفتوح المصدر J من كومة من الصور الأولية ، ويستخرج الماكرو الأول الخلايا الفردية وينشئ خلية مرجعية. يقيس الماكرو الثاني انهيار غشاء الخلية.

الخطوة الأولى هي تجزئة الخلايا الفردية من الصور الأولية. تستخدم صور النمط الصغير المسمى بالفلورسنت لإزالة المناطق التي تتمحور حول الأنماط الدقيقة التي يتم اقتصاصها على الصور لكل طول موجي وإعادة تجميعها في أكوام لكل طول موجي. لتحديد الأنماط الدقيقة ذات الخلايا المفردة ، يكتشف الماكرو عدد النوى لكل صورة ويزيل في جميع المكدسات تلك التي تحتوي إما على أكثر من نواة واحدة أو لا توجد نوى.

أخيرا ، يتم استخدام التسجيل متعدد المكدس للمكون الإضافي للصورة J لإعادة محاذاة جميع الصور التي تم جمعها وجميع القنوات بناء على موضع النمط الصغير. تقوم هذه الخطوة بإنشاء مجموعات أسطر من الصور الفردية التي يمكن استخدامها الآن لتحليل خلية واحدة أو لإنشاء خلية مرجعية. في الصورة J، يتم إنشاء الخلية المرجعية عن طريق عمل إسقاط للصور التي تمت تصفيتها ومحاذاتها من مكدس.

يمكن تطبيق العديد من طرق الإسقاط ، ولكن عادة ما يتم اختيار إسقاط متوسط للتخلص من القيم المتطرفة لمكدس الصور. الخلية المرجعية هي أداة فريدة ومفيدة للتمثيل وتحليل الصور التي يتم الحصول عليها فقط باستخدام خلايا النمط الدقيق. لتسهيل فحصها ، يتم تطبيق جدول بحث أو جدول بحث لتحويل الصورة أحادية اللون إلى خريطة تردد مشفرة.

لتوصيف تأثير الستاتين BLEs ، تم تحليل صلابة الخلية وانهيار الخلية باستخدام صورة ثانية J macro. باختصار ، يتم استخدام صور العتبة للنمط الصغير L لتحديد الوتر النظري لشكل مثلث الخلية. يتم إجراء العتبة التالية لصور صبغة أكتون لتحديد شكل الخلية.

يتم قياس الفرق في المساحة بين الوتر النظري وغشاء الخلية المقعر الفعلي ، وتعتبر الخلايا التي تقدم منطقة أسفل الوتر النظري منهارة. تميز تأثير خمسة ميكرومولار BLEs الستاتين من خلال مقارنة عدد الخلايا المنهارة في الظروف المعالجة والطبيعية. تظهر الصور النموذجية لخلايا النمط الدقيق L المعالجة بالعقاقير المخفضة للكوليسترول أو التي تركت دون معالجة ، وكانت الخلايا ثابتة وملطخة بالأنماط الدقيقة.

يظهر الأكتين والنوى باللون الأحمر والأخضر والأزرق على التوالي. لاحظ تأثير الستاتين BLEs على شكل الخلية مقارنة بظروف التحكم. تظهر هنا الخلايا التمثيلية بعد الحضانة باستخدام BLEs الستاتين أو الضوابط على الفيبرونيكتين العادي.

تم تثبيت الخلايا وتكون الأكتين والنوى ملطخة باللونين الأخضر والأزرق على التوالي. لاحظ التشابه بين الحالات المعالجة والحالات الخاضعة للرقابة. يتم عرض صور نموذجية للخلايا المرجعية التي تم الحصول عليها من الخلايا المعالجة بالعقاقير المخفضة للكوليسترول أو التي تركت دون معالجة.

لاحظ إمكانات هذا النهج لسهولة ملاحظة النمط الظاهري قيد الدراسة. فيما يلي مثال على تحليل تأثيرات الستاتين BLEs على الخلايا باستخدام الوتر الكلي. بينما انهارت 25٪ من خلايا التحكم ، زاد هذا ثلاثة أضعاف 75٪ في الخلايا المعالجة بالعقاقير المخفضة للكوليسترول الخمسة ميكرومولار التي تعكس شبكة انقباض الأكتينين الضعيفة.

بعد مشاهدة هذا ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية حل الأنماط الدقيقة اللاصقة للعديد من الاختناقات في تحليل المحتوى العالي. أولا ، جعل استخدام الأنماط الدقيقة اللاصقة تحليل معالجة التقاط الصور أكثر وضوحا. ثانيا ، تسمح الأنماط الدقيقة باكتشاف التأثيرات الدقيقة للغاية للأدوية بجرعات منخفضة جدا لأنك تقلل من التباين من خلية إلى أخرى عن طريق تطبيع مورفولوجيتها وسلوكها.

وأخيرا ، مقارنة بآلاف الخلايا التي عادة ما تكون ضرورية للحصول على نتيجة جيدة في تحليل الخلايا ، فأنت تحتاج فقط إلى بضع عشرات من الخلايا للحصول على نتيجة قوية ومهمة باستخدام الخلية المرجعية الخاصة بنا.