تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التنظيم الزمني الحاسم المطلوب لتمايز الخلايا العضلية القلبية في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران. ويتم تحقيق ذلك من خلال تكوين الأجسام الجنينية أولاً في طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً لتوحيد عملية تكوين الـ EB كخطوة ثانية. ثم تُضاف المُعدِّلات البروتينية أو الكيميائية إلى الـ EBS عبر مسار زمني محدد مسبقاً، مما يسمح بالتحكم الزمني في المسارات قيد الفحص.

بعد ذلك، يتم قياس عدد أجسام EMB النابضة يدويًا لتحديد كفاءة تحفيز مخططات تعديل الإشارات المختلفة. تم الحصول على نتائج توضح المتطلبات الزمنية لمسارات الإشارات الأساسية لتمايز الخلايا العضلية القلبية بناءً على النسبة المئوية لأجسام EBS النابضة المتكونة والتأكيد باستخدام طريقة القطرة المعلقة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل القطرات المعلقة في أنها توحد وتبسط إجراءً يتطلب عمالة مكثفة وتسمح بقراءة مباشرة للقياس الكمي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية، مثل تحديد عوامل التخثر التأشيرية الأساسية التي توجه التمايز نحو نوع الخلايا المطلوب. لبدء هذا الإجراء، يتم استزراع الخلايا الجذعية الجنينية للفئران في أطباق زراعة خلايا بحجم 10 centimeter باستخدام وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران المكمل بعامل تثبيط اللوكيميا. وتكون الخلايا الجذعية الجنينية جاهزة للاستخدام عندما تصل نسبة تلاقي الخلايا (confluence) إلى 50 إلى 70%.

قم بإزالة وسط ES واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 mL من محلول PBS المعقم. أضف 2 mL من tripsin EDTA بتركيز 0.05% إلى كل طبق، ثم حضن الأطباق عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإيقاف مفعول tripsin EDTA بإضافة 3 mL من وسط ES لكل طبق، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL.

قم بالتدوير بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا بالكمية المطلوبة من وسط EB. قم بعدد الخلايا ثم خففها لتصل إلى 5 × 10³ خلية لكل ملليلتر.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من وسط EB الذي يحتوي على الخلايا في كل بئر من صفائح ميكروتيتر ذات 96 بئرًا مستديرة القاع. سيعتمد عدد الصفائح ذات 96 بئرًا المطلوبة على عدد الظروف والنقاط الزمنية للتجربة. ضع صفائح ميكروتيتر ذات 96 بئرًا مستديرة القاع في حاضنة رطبة عند 37 °C و 5% carbon dioxide لتحديد النوافذ الزمنية الحرجة لمسارات الإشارات الرئيسية لتكوين القلب.

تُضاف مُعدِّلات لمسارات تأشير محددة إلى الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells). وفي أطباق ذات 96 بئراً مستديرة القاع، يُضاف مُعدِّل التأشير، المُخفف في الوسط الغذائي، إلى كل بئر في نقاط زمنية مختلفة. وتُستخدم نصف الآبار في كل طبق من الأطباق ذات 96 بئراً لكل نقطة زمنية لبدء المعالجة.

تتم إضافة ضابط المركبة (vehicle control) إلى الآبار الـ 48 الأخرى لكل نقطة زمنية. وعند نقاط توقف مختلفة، سنقوم بغسل مُعدِّلات الإشارات من كل بئر عن طريق تغيير الوسط، ويجب توخي الحذر الشديد عند القيام بذلك لتجنب إزعاج الأجسام الجنينية. في نقاط زمنية مختلفة للتوقف، يتم غسل المُعدِّلات عن طريق تغيير وسط الـ EB للآبار. يتم إمالة لوحة الـ 96 بئر بزاوية 10 درجات تقريبًا وإزالة الوسط برفق من البئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.

ثم أضف وسط EB الخالي من المنظم مرة أخرى إلى كل بئر لأي معالجة تزيد مدتها عن 48 ساعة. قم بتغيير وسط EB المكمل بمنظمات جديدة كل يومين حتى وقت التوقف المطلوب. في النقاط الزمنية التي تلي سبعة أيام من تحفيز تكوين EBS عن طريق نقل خلايا ES إلى أطباق ذات 96 بئراً، افحص انكماش EB تحت المجهر.

يتم تقييم الآبار التي تحتوي على EBS منقبضة على أنها إيجابية للحصول على النسب المئوية لـ EBS المنقبضة لكل مسار زمني مختلف للمعالجة. يمكن التحقق من النوافذ الزمنية لإشارات تكوين القلب التي تم تحديدها بواسطة تجارب أطباق 96 بئرًا في EBS المصنوعة من القطرات المعلقة لإنشاء قطرات EB معلقة. أولاً، يتم تحضير أطباق بتري عن طريق إضافة ثلاثة إلى أربعة milliliters من PBS لمنع انحراف القطرات لاحقاً.

بعد ذلك، يتم سكب معلق من خلايا ES تم تحضيره بكثافة نهائية تبلغ 2.5 × 10⁴ خلية لكل ملليلتر في طبق بكتيري لسهولة الوصول إليه. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم إضافة قطرات بحجم 20 µL من خلايا ES على الأغطية المقلوبة لأطباق Petri. يجب عدم السماح للقطرات المنفردة بملامسة بعضها البعض.

بشكل عام، يمكن للغطاء الواحد أن يستوعب ما يصل إلى 80 قطرة. بعد ذلك، اقلب الغطاء فوق طبق بتري الذي يحتوي على PBS واحضنه لمدة 48 ساعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius و5%carbon dioxide للسماح بتكوين أجسام جنينية (EB). وبعد مرور 48 ساعة، اغسل الأجسام الجنينية المتكونة من القطرات المتدلية من كل غطاء باستخدام ثلاثة milliliters من وسط نمو EB.

انقل غطاءين من الـ EBS إلى طبق بتري جديد. يتم تحضين طبق البتري لمدة أربعة أيام في حاضنة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius ونسبة 5%carbon dioxide، وفي اليوم الرابع، يتم نقل الـ EBS المعلقة إلى أطباق سداسية الفجوات مغطاة بـ 0.2%Gelatin بشكل عام. يتم نقل 30 من الـ EBS إلى كل فجوة، وتُحضن مع معدلات الإشارة في الفترة الزمنية المحددة من تجارب أطباق الـ 96 فجوة، وذلك بعد سبعة أيام من تكوين القطيرات المعلقة.

افحص الأجسام الشبيهة بالأجنة (EBS) تحت المجهر لرصد انقباضها؛ حيث ستشكل الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells) النامية في الآبار ذات القاع المستدير لصفيحة ذات 96 بئراً أجساماً شبيهة بالأجنة (EBS)، كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية لجسم شبيه بالجنين (EB) تم تكوينه في اليوم الرابع. وتعتبر النقاط الزمنية الحرجة لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا قلبية (cardio genesis) هي النوافذ الزمنية التي تحتوي على أعلى نسبة من الأجسام الشبيهة بالأجنة (EBS) المنقبضة والمعالجة بمعدلات الإشارات عند مقارنتها بمجموعة التحكم (vehicle control). يظهر هنا بؤرة انقباض تلقائي لخلايا عضلة القلب تشكلت من خلايا جذعية جنينية معالجة بالمورفين الظهري في اليوم 10 من التمايز على صفيحة معايرة دقيقة ذات 96 بئراً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحديد الفعال للتنظيم الزمني الحرج، ونوافذ مسارات الإشارات الرئيسية في تكوين القلب من الخلايا الجذعية الجنينية (ES).