تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التنظيم الزمني الحاسم المطلوب لتمايز خلايا عضلة القلب في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشكيل الأجسام الجنينية أولا في صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا لتوحيد تكوين EB كخطوة ثانية. تتم إضافة معدلات البروتين أو المواد الكيميائية إلى EBS خلال مسار زمني محدد مسبقا ، مما سيسمح بالتحكم الزمني في المسارات قيد الفحص.

بعد ذلك ، يتم قياس EBS يدويا لتحديد كفاءة الحث لمخططات تعديل الإشارة المختلفة. تم الحصول على النتائج التي توضح المتطلبات الزمنية لمسارات الإشارات الأساسية لتمايز خلايا عضلة القلب بناء على النسبة المئوية لضرب EBS المتكونة والتأكيد باستخدام طريقة السقوط المعلق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل القطرات المعلقة ، هي أنها توحد وتبسط الإجراء كثيف العمالة وتسمح بقراءة مباشرة للقياس الكمي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، مثل تحديد تخثر الإشارات الأساسي الذي يوجه التمايز نحو نوع الخلية المطلوب لبدء هذا الإجراء. الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في صفائح زراعة الخلايا 10 سنتيمترات مع وسط خلية ES للفأر مكمل بعامل مثبط لسرطان الدم. عندما تكون الخلايا الجذعية الجنينية عند التقاء 50 إلى 70٪ ، تكون جاهزة للاستخدام.

قم بإزالة وسائط ES واشطف الخلايا مرة واحدة بخمسة ملليلتر من PBS المعقم. أضف ملليلترين من 0.05٪ تريبسين في EDTA إلى كل طبق ، واحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإخماد الرحلات في EDTA بثلاثة ملليلتر من وسائط ES لكل لوحة وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.

تدور بمعدل 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supinate وإعادة تعليق حبيبات الخلية بالكمية المطلوبة من وسائط EB. احسب رقم الخلية ثم خفف الخلايا إلى خمسة في 10 إلى الخلايا الثلاث لكل مليلتر.

في وسائط EB باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من وسائط EB التي تحتوي على خلايا في كل بئر من صفيحة ميكروتيتر بئر ذات قاع دائري مكون من 96 نقطة. يعتمد عدد 96 لوحة بئر مطلوبة على عدد الشروط والنقاط الزمنية للتجربة. ضع 96 لوحة ميكروتيتر بئر مستديرة في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لتحديد النوافذ الزمنية الحرجة لمسارات الإشارات الرئيسية لتكوين القلب.

تتم إضافة معدلات مسارات إشارات محددة إلى خلايا ES. في 96 لوحة بئر قاعية مستديرة ، أضف معدل الإشارات ، والذي يتم تخفيفه في الوسائط في كل بئر في نقاط زمنية مختلفة. يتم استخدام نصف الآبار في كل 96 لوحة بئر لكل نقطة زمنية لبدء المعالجة.

تتم إضافة التحكم في السيارة إلى الآبار ال 48 الأخرى لكل نقطة زمنية في نقاط التوقف المختلفة ، سنقوم بغسل معدلات الإشارات من كل بئر عن طريق تغيير الوسائط ويجب توخي الحذر الشديد عند القيام بذلك لمنع تعطيل الأجسام الجنينية عند نقاط زمنية مختلفة للتوقف اغسل المعدلات عن طريق تغيير وسائط EB للآبار. قم بإمالة لوحة البئر 96 بزاوية 10 درجات تقريبا وقم بإزالة الوسط برفق من البئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.

ثم أضف وسائط EB بدون معدل إلى كل بئر لأي علاج لمدة تزيد عن 48 ساعة. قم بتغيير وسائط EB المكملة بمعدلات جديدة كل يومين حتى وقت التوقف المطلوب. بعد سبعة أيام من تحفيز EBS عن طريق نقل الخلايا الجذعية الجذعية إلى 96 لوحة بئر ، تفحص تقلص EB تحت المجهر.

قم بتسجيل الآبار المتعاقدة مع EBS كآبار إيجابية للحصول على نسب مئوية من التعاقد مع EBS لكل دورة زمنية مختلفة للعلاج. يمكن التحقق من النوافذ الزمنية للإشارات لتكوين القلب التي تم تحديدها بواسطة 96 تجربة للوحة البئر في EBS المصنوعة من قطرات معلقة لعمل قطرات EB معلقة. قم أولا بإعداد أطباق بتري عن طريق إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من PBS للانحراف الوقائي للقطرات لاحقا.

بعد ذلك ، يتم سكب معلق خلية ES المحضر بكثافة نهائية تبلغ 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل مليلتر في طبق بكتيري لسهولة الوصول إليه. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 20 ميكرولتر قطرة من الخلايا الجذعية الجنينية على الأغطية المقلوبة لأطباق بتري. لا تسمح للقطرات الفردية بلمس بعضها البعض.

بشكل عام ، يمكن أن يتسع غطاء واحد لما يصل إلى 80 نقطة. ثم اقلب الغطاء مرة أخرى فوق طبق بتري الذي يحتوي على حاضنة PBS لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون للسماح بتكوين EB. بعد 48 ساعة ، اغسل EBS المكونة من قطرات معلقة من كل غطاء بثلاثة ملليلتر من وسائط EB.

اسحب غطاءين من EBS في طبق بتري جديد. احتضان طبق بتري لمدة أربعة أيام في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في اليوم الرابع ، وانقل EBS في التعليق إلى 0.2٪ مغلفة بالجيلاتين ستة ألواح آبار بشكل عام. يتم نقل 30 EBS إلى كل معدلات إشارات احتضان بئر في الفترة الزمنية المحددة من تجارب 96 لوحة البئر بعد سبعة أيام من عمل القطرات المعلقة.

راقب EBS تحت المجهر بحثا عن تقلص EB ستشكل الخلايا الجذعية الجذعية المزروعة في الآبار القاعية المستديرة لصفيحة بئر 96 EBS كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية ل EB الذي تم تشكيله في اليوم الرابع. النقاط الزمنية الحرجة لتكوين القلب ES هي النوافذ الزمنية التي تحتوي على أعلى نسبة من التعاقد مع EBS المعالجة بواسطة معدلات الإشارات عند مقارنتها بالتحكم في السيارة. يظهر هنا تركيز متقلص تلقائيا لخلايا عضلة القلب المتكونة من خلايا ES المعالجة بالمورفين الظهري في اليوم العاشر من التمايز على صفيحة ميكروتيتر 96 بئر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد التنظيم الزمني الحرج بكفاءة ، ونوافذ مسارات الإشارات الرئيسية في تكوين القلب ES.