التحول الجيني القائم على نواقل الكروموسوم الاصطناعية البكتيرية الثنائية في نباتات نبات الأرابيدوبس: تقنية لتوليد نباتات معدلة وراثيا بإدخال نسخة واحدة

ابدأ بنباتات نبات الأرابيدوبسيس التي تحمل رؤوس أزهار غير ناضجة. اغمس رؤوس الأزهار في معلق خلية Agrobacterium الذي يحمل T-DNA المستنسخ بكروموسوم اصطناعي بكتيري ثنائي أو BIBAC ، وهو ناقل يتكاثر في كل من بكتريا قولونية ونظامي Agrobacterium. يمكن أن يوفر ناقل T-DNA الثنائي هذا الجينات المعدلة وراثيا كبيرا مثل جين مقاومة مبيدات الأعشاب وعلامات الفلورسنت القابلة للتحديد على طول محفز خاص بالبذور.

بينما لا تزال رؤوس الزهور مغمورة ، قم بتحريك النباتات برفق لتعزيز ملامستها مع Agrobacterium. بفضل قدرته المتأصلة على إصابة النباتات ، ينقل Agrobacterium الجينات المعدلة إلى الخلية الزهرية عندما يدخل الجين المعدل إلى الخلية ، ينتقل إلى النواة ويندمج مع جينوم النبات.

الآن ، لف النبات في غلاف بلاستيكي واحتضانه في الظلام للاحتفاظ بالرطوبة لتحسين التحول. قم بإزالة الفيلم وزراعة النباتات في ظل ظروف فسيولوجية حتى تنتج البذور.

بعد ذلك ، قم بحصاد البذور وراقبها تحت المجهر الفلوري لاختيار المحولات. الآن ، قم بزراعة البذور المحولة في ظروف مناسبة حتى الإنبات. رش النباتات بمبيدات الأعشاب واحتضنها.

تعاني النباتات ذات الإدراج المتعدد للجينات المعدلة من إسكات الجينات وتذبل ، في حين أن النباتات ذات الإدخال أحادي النسخة تعبر عن إنزيم نشط لتمثيل التمثيل الغذائي لمبيدات الأعشاب وتبقى على قيد الحياة من العلاج. استخراج الحمض النووي الجيني من المحولات الباقية وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لحساب كفاءة الإدخال أحادي النسخة.

لتحضير نباتات نبات الأرابيدوبسيس للتحول ، قم بزراعة نباتات نبات الأرابيدوبسيس في دفيئة أو غرفة نمو يتم التحكم فيها بالمناخ ، حتى تزهر. قم بقص البراغي الأولى للسماح بظهور المزيد من البراغي الثانوية. تكون النباتات جاهزة للغطس بعد أربعة إلى ستة أيام من القص ، عندما تحتوي النباتات على العديد من رؤوس الزهور غير الناضجة ، وليس هناك الكثير من السيليك المخصب.

لأداء غمس الأزهار ، اغمس النورات لمدة 5 إلى 10 ثوان في تعليق Agrobacterium. استخدم التحريض اللطيف. لف الأجزاء الموجودة فوق سطح الأرض من النباتات في غلاف بلاستيكي للحفاظ على الرطوبة عالية ، وقم بتغطية أواني النباتات بصندوق لإبقاء النباتات في الظلام.

احتضان النباتات لمدة يومين في دفيئة أو غرفة نمو. بعد يومين ، قم بإزالة الصندوق وفيلم التشبث ، وقم بزراعة النباتات حتى تنضج في دفيئة أو غرفة نمو. لزيادة كفاءة التحول ، يمكن إعادة غمس نفس النباتات بعد سبعة أيام من الغمس الأول.

بعد ذلك ، عندما تنضج النباتات المحولة وجافة ، احصد البذور. قم بتجميع وتحليل بذور النباتات المحولة بنفس بنية مجموعة واحدة. في حالة تحويل النباتات باستخدام مشتق البلازميد BIBAC-RFP-Gateway ، حدد النباتات المعدلة وراثيا عن طريق تحليل البذور باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

للكشف عن تعبير DsRed في طبقات البذور ، قم بتصوير البذور عند إثارة 560 نانومتر ، وانبعاث من 600 إلى 650 نانومتر. افصل البذور الفلورية عن نظيراتها غير الفلورية باستخدام الملقط.

للكشف عن النباتات المعدلة وراثيا التي تم تحويلها باستخدام مشتق البلازميد BIBAC-BAR-Gateway ، قم بزرع البذور في صواني مملوءة بالتربة. تأكد من الانتشار المتساوي للبذور على الصواني، عن طريق تعليق البذور في أجار 0.1٪ في وسط MS 0.5X، ونشر البذور باستخدام ماصة سعة 1 ملليلتر.

حفز البذور على الإنبات بطريقة متزامنة عن طريق احتضان البذور لمدة يومين على الأقل عند 4 درجات مئوية. يمكن القيام بذلك قبل أو بعد زرع البذور. بعد أسبوعين وثلاثة أسابيع من زرع البذور ، رش الشتلات بمحلول جلوفوسينات الأمونيوم بنسبة 0.5٪. استخدم 500 مل من محلول جلوفوسينات الأمونيوم لكل 1 متر مربع. انقل الشتلات الباقية إلى الأواني. تحليل النباتات المقاومة للجلوفوسينات الأمونيوم ، بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لوجود البناء ذي الأهمية.