توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة باستخدام ناقل ثنائي بيبك-GW

الهدف العام لهذه المنهجية هو توليد نباتات معدلة وراثيا تحمل إدخالات سليمة ونسخة واحدة من الحمض النووي المنقول ، أو T-DNA ، بطريقة فعالة. يعد متجه BIBAC-Gateway أداة قيمة لتوليد نباتات معدلة وراثيا تحمل عمليات إدخالات سليمة ونسخة واحدة من التسلسلات ذات الأهمية التي تظهر تعبيرا جينيا مستقرا. باستخدام متجه BIBAC-Gateway ، يمكن للمرء استخدام تقنية إعادة تركيب البوابة لإدراج تسلسلات ذات أهمية بأقل جهد.

جميع مشتقات BIBAC ، بما في ذلك نواقل BIBAC-Gateway ، مناسبة لنقل شظايا الحمض النووي الكبيرة المعدلة وراثيا إلى جينومات النبات. يمكن استخدام نواقل BIBAC-GW لإدراج تسلسلات ذات أهمية في العديد من أنظمة النباتات ، مثل الذرة والأرز والطماطم. هناك نوعان من البلازميدات BIBAC-GW المتاحة.

يحتوي البلازميد BIBAC-RFP-GW على جين DsRed يتم التعبير عنه في طبقات البذور. يحتوي بلازميد BIBAC-BAR-GW على جين يوفر مقاومة للجلوفوسينات. يحتوي كلا الناقلين على جين مقاوم للكاناميسين كعلامة انتقاء في البكتيريا.

لإدراج التسلسلات ذات الأهمية في المتجه الثنائي ، قم أولا بإعداد إدخال البوابة والمتجهات الثنائية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء تفاعل البوابة ، قم بإعداد تفاعل إعادة التركيب LR وفقا لاقتراحات المورد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر في درجة حرارة الغرفة. امزج 100 إلى 300 نانوجرام من استنساخ الدخول فائق الالتفائف و 300 نانوجرام من متجه BIBAC-Gateway.

اضبط حجم الخليط إلى 16 ميكرولتر باستخدام TE. أخيرا ، أضف أربعة ميكرولترات من مزيج إنزيم LR Clonase ، واخلطها عن طريق الدوامة. احتضان الخليط على حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة. قم بإنهاء تفاعل LR بإضافة ميكرولترين من محلول البروتيناز K إلى الخليط.

امزج واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الشروع في التحول إلى الإشريكية القولونية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحضير نباتات نبات نبات الأرابيدوبسيس للتحول ، قم بزراعة نباتات نبات الأرابيدوبسيس في دفيئة أو غرفة نمو يتم التحكم فيها بالمناخ حتى تزهر. قم بقص البراغي الأولى للسماح بظهور المزيد من البراغي الثانوية.

تكون النباتات جاهزة للغطس بعد أربعة إلى ستة أيام من القص ، عندما تحتوي النباتات على العديد من رؤوس الزهور غير الناضجة وليس هناك الكثير من الألواح المخصبة. لأداء غمس الأزهار ، اغمس النورات لمدة خمس إلى 10 ثوان في تعليق Agrobacterium. استخدم التحريض اللطيف.

لف الأجزاء الموجودة فوق سطح الأرض من النباتات في غلاف بلاستيكي للحفاظ على الرطوبة عالية ، وقم بتغطية أواني النباتات بصندوق لإبقاء النباتات في الظلام. احتضان النباتات لمدة يومين في دفيئة أو غرفة نمو. بعد يومين ، قم بإزالة الصندوق وفيلم التشبث وقم بزراعة النباتات حتى النضج في دفيئة أو غرفة نمو.

لزيادة كفاءة التحول ، يمكن إعادة غمس نفس النباتات بعد سبعة أيام من الغمس الأول. بعد ذلك ، عندما تنضج النباتات المحولة وجافة ، احصد البذور. قم بتجميع وتحليل بذور النباتات المحولة بنفس بنية مجموعة واحدة.

في حالة تحويل النباتات باستخدام مشتق البلازميد BIBAC-RFP-Gateway ، حدد النباتات المعدلة وراثيا عن طريق تحليل البذور باستخدام الفحص المجهري الفلوري. للكشف عن تعبير DsRed في طبقات البذور ، قم بتصوير البذور عند إثارة 560 نانومتر وانبعاث من 600 إلى 650 نانومتر. افصل البذور الفلورية عن نظيراتها غير الفلورية باستخدام الملقط.

للكشف عن النباتات المعدلة وراثيا التي تم تحويلها باستخدام مشتق البلازميد BIBAC-BAR-Gateway ، قم بزرع البذور في صواني مملوءة بالتربة. تأكد من الانتشار المتساوي للبذور على الصواني عن طريق تعليق البذور في 0.1٪ أجار في وسط MS 0.5x ، ونشر البذور باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد. حفز البذور على الإنبات بطريقة متزامنة عن طريق احتضان البذور لمدة يومين على الأقل عند أربع درجات مئوية.

يمكن القيام بذلك قبل أو بعد زرع البذور. بعد أسبوعين وثلاثة أسابيع من زرع البذور ، رش الشتلات بمحلول 0.5٪ جلوفوسينات الأمونيوم. استخدم 500 مل من محلول جلوفوسينات الأمونيوم لكل متر مربع.

انقل الشتلات الباقية إلى الأواني. تحليل النباتات المقاومة للجلوفوسينات والأمونيوم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لوجود البنية ذات الأهمية. تحديد عدد عمليات تكامل T-DNA وسلامتها عن طريق نشاف الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد.

تسمح هذه الطريقة بتحديد عمليات التكامل الفردية والمتكررة في نفس المواقع أو مواقع مختلفة في الجينوم. استخدم سلسلة من عمليات الهضم التقييدية لتحديد أنماط التكامل المختلفة الممكنة. حدد إنزيما يقطع مرة واحدة في منتصف T-DNA ، لتتمكن من استكشاف التسلسلات بشكل مستقل في المنبع وأسفل موقع التقييد.

أيضا ، حدد إنزيما أو مجموعة من الإنزيمات التي تقطع التسلسل الكامل للاهتمامات في وقت واحد. احرص على استخدام إنزيمات التقييد فقط غير الحساسة لمثيلة السيتوزين. بعد إجراء نشاف الحمض النووي ، كما هو مفصل في بروتوكول النص ، قم بإجراء تحليل اللطخة.

يعتمد التحليل على استراتيجية التقييد المستخدمة. عند تحليل اللطخة باستخدام الإستراتيجية مع موقع تقييد واحد في منتصف T-DNA ، احسب عدد الأجزاء المكتشفة. في هذه الإستراتيجية ، يشير عدد الأجزاء المهجنة إلى عدد عمليات تكامل T-DNA.

قارن عدد الأجزاء المكتشفة بمسبار للجانب الأيسر والأيمن من T-DNA. إذا تم اكتشاف عدد مختلف من شظايا التهجين باستخدام المجسين ، فإما أن تكاملات T-DNA المتعددة في تكرار مقلوب أو T-DNA متكاملة بشكل غير كامل. لتحديد الترتيبات الترادفية والمقلوبة ل T-DNAs ، قم بتقدير أحجام شظايا التهجين على اللطخة بناء على حجم نطاقات العلامات ، وقارن الأحجام المقدرة بأحجام الشظايا المتوقعة المحسوبة بناء على استراتيجية التقييد.

لفحص ما إذا كان التسلسل المعدل وراثيا محل الاهتمام سليما ، قم بتحليل اللطخة المعدة وفقا للاستراتيجية مع مواقع التقييد في أطراف تسلسل الاهتمام. قم بتقدير حجم الأجزاء المهجنة على اللطخة بناء على حجم نطاقات العلامات ، ومقارنتها بالحجم المتوقع. ينتج عن الإدراج السليم جزء واحد بطول محدد.

يشير أي انحراف عن الطول المتوقع إلى تكامل غير مكتمل. يتم عرض استراتيجية تقييد الحمض النووي والنشاف لتحديد عدد وسلامة تكامل T-DNA. يقسم موقع تقييد ScaI تسلسل المراسل إلى الأجزاء القريبة للحدود اليسرى التي يتم اكتشافها عند استخدام مسبار للشريط والأجزاء القريبة للحدود اليمنى التي يتم اكتشافها عند استخدام مسبار ل eYFP.

يتم وضع مواقع تقييد BglII و PciI داخل T-DNA ، خارج بنية المراسل. ينتج عن الهضم المزدوج جزء بحجم محدد ، وأي انحراف هو مؤشر على عمليات إدخال غير مكتملة. يعكس عدد الأجزاء المهجنة التي تم تحديدها عدد عمليات إدخال T-DNA.

تهجين لطخة واحدة تحتوي على الحمض النووي الجيني لتسعة جينات معدلة وراثيا تم هضمها باستخدام ScaI مع مجسات بار و eYFP. تشير العديد من الممرات إلى الجينات المعدلة وراثيا مع تكامل T-DNA الفردي. يعرض الممر الرابع جزأين مع شريط وواحد مع eYFP ، مما يشير إما إلى اقتطاع تسلسل eYFP أو تكرار مقلوب حول الحد الأيمن.

يعرض الممر السادس جزأين مع شريط و eYFP. جزء واحد له شدة ضعيفة مع مسبار الشريط. الجزء الآخر له كثافة عالية ، مما يشير إلى إدخالين من T-DNA ، أحدهما مقتطع.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج تسلسل الحمض النووي الخاص بك الذي يثير اهتمامك في متجه ثنائي BIBAC-GW باستخدام إعادة تركيب البوابة ، متبوعا بتحويل نبات الأرابيدوبسيس ، وفحصه ، وتقييم عدد عمليات تكامل T-DNA وسلامتها. يستغرق توليد وتوصيف النباتات المعدلة وراثيا وقتا طويلا. عند استخدام BIBAC-Gateway كمتجه ثنائي ، يمكن تقصير عملية تحديد الجينات المعدلة وراثيا مع عمليات تكامل سليمة أحادية النسخة.

حوالي نصف الجينات المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها باستخدام مشتقات BIBAC تحمل تكاملات سليمة أحادية النسخة. بشكل عام ، لا يدرك الأفراد أن العديد من النباتات المعدلة وراثيا التي يتم إنشاؤها باستخدام النواقل الثنائية الشائعة تحمل نسخا مقطوعة من الجينات المعدلة وراثيا أو الجينات المعدلة وراثيا التي تظهر إسكات الجينات. مع مشتقات BIBAC ، تحمل معظم النباتات المعدلة وراثيا المتولدة تكاملات فردية سليمة للجين المعدل وراثيا نادرا ما تظهر إسكات الجينات.

عند استخدام BIBAC-GW لتوليد الجينات المعدلة وراثيا ، من المهم تحويل عدد كاف من المواد النباتية ، حيث أن كفاءة التحويل الإجمالية لمشتقات BIBAC أقل من تلك الخاصة بالمتجهات الثنائية شائعة الاستخدام. تتراوح كفاءة تحويل BIBAC-GW بشكل عام بين 0.2٪ و 0.5٪ بعد تحديد النباتات المعدلة وراثيا التي تحمل تكاملات T-DNA السليمة أحادية النسخة ، إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء مزيد من التحليل لتحديد الموقع الجيني الدقيق لإدخال T-DNA. تظهر الجينات المعدلة وراثيا ذات التكامل السليم أحادي النسخة مستويات تعبير مماثلة للجينات المعدلة وراثيا.

يشير هذا إلى أن موضع تكامل T-DNA في الجينوم له تأثير ضئيل على مستوى التعبير عن الجين المحور.