التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

قمنا بتطوير طريقة جديدة للتعبير عن المشترك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات للتغلب على صعوبات الطرق التقليدية. ويستفيد من استخدام بلازميد تعبير واحد يحتوي على بروتين مستقلة وظيفيا متعددة معربا عن أشرطة الكاسيت لتحقيق التعبير البروتين المشارك.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية النباتية مثل ، كيف يمكننا تكوين البروتينات في الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكفاءة العالية للتعبير المشترك عن بروتينات الاندماج الخلوي في ناقل تعبير واحد. سيوضح الإجراء Guitao Zhong ، طالب دراسات عليا من مختبرنا.

للبدء ، قم بتصميم الاشعال للاستنساخ الجزيئي لشظايا الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص. تضخيم شظايا الحمض النووي الضرورية لبناء أشرطة التعبير عن البروتين شبه المستقلة عن طريق تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية مع البادئات المقابلة لها والبوليميراز عالي الدقة. وتشمل هذه المروج ، ومراسل الفلورسنت ، والجين المستهدف ، والفاصل.

افحص جودة منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من الجولة الأولى من خلال البحث عن تدهور الحمض النووي وتلوثه بالرحلان الكهربائي للحمض النووي باستخدام هلام الاغاروز بنسبة 1٪. حدد كمية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يجب أن تكون النسبة بين القراءات عند 260 و 280 نانومتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بين 1.6 و 1.8.

امزج شظايا الحمض النووي المصممة لنفس كاسيت تعبير البروتين معا في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات. حول خلط DNS من بيانات كاسيت التعبير المختلفة. نظرا لأن المساواة تقلل من كفاءة تجميع الحمض النووي ، بسبب زيادة أعداد جزيئات الحمض النووي التي تحتاج إلى ربطها.

الآن ، أضف 15 ميكرولترا من خليط 2x الرئيسي إلى خليط الحمض النووي سعة 5 ميكرولتر واحتضانه عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بتضخيم كاسيت التعبير عن البروتين شبه المستقل بالكامل بجولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). استخدم 0.5 إلى ميكرولتر واحد من المنتج من تفاعل التجميع متساوي الحرارة في الجولة الأولى كقالب في البادئات الخارجية.

استخدم وحدة واحدة من البوليميراز عالي الدقة في حجم تفاعل 50 ميكرولتر لمدة 30 دورة ، متبوعا بامتداد نهائي عند 68 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بخطية متجه العمود الفقري للتعبير النهائي عن البروتين POC 18 ، والمتجه CAMBIA 1300 ، عن طريق إضافة أربع وحدات من وحدة صغيرة واحدة إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر. تم تصميم هذه النواقل للتعبير العابر عن البروتين والتحول الجيني.

احتضان ملخص التقييد لمدة ساعة إلى ساعتين عند 25 درجة مئوية. بعد الهضم ، قم بتعطيل إنزيم التقييد عن طريق الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بخلط جزيئات الحمض النووي متساوي المولار لأشرطة التعبير عن البروتين والمتجه النهائي الخطي في حجم تفاعل نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات.

أخيرا ، قم بإجراء الجولة الثانية من إعادة تركيب الحمض النووي عن طريق خلط التفاعل مع 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت الرئيسي 2x ، واحتضانه عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. لتحضير خلايا تعليق التبغ BY-2 للقصف ، قم بتصفية 30 مل من خلايا BY-2 المزروعة لمدة 3 أيام على قطعة من ورق الترشيح المعقم سعة 70 مليلتر عبر مضخة تفريغ ، عن طريق ضبط ضغط الفراغ على 40 ملليبار. في هذه الأثناء ، أضف عدة قطرات من الوسط الثقافي السائل لخلية BY-2 في طبق بتري.

انقل ورق الترشيح مع خلايا BY-2 عليه إلى طبق بتري. لتحضير نباتات الأحداث الأرابيدوبسيس للقصف ، قم بإعداد نباتات عينات عمرها سبعة أيام كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بنقلها إلى مستطيل في وسط صفيحة متوسطة جديدة MS نصف القوة لزيادة كفاءة القصف.

احرص على تجنب تداخل النباتات عند نقلها ووضعها على الطبق. أضف عدة قطرات من الوسط السائل MS نصف القوة على سطح النباتات أو الأنسجة للحفاظ على الرطوبة ومنع جفاف النباتات خلال الخطوات المتبقية. لطلاء جزيئات الذهب بالحمض النووي البلازميد ، قم أولا بدوامة محلول الناقل الدقيق للذهب جيدا لمدة ثلاث دقائق.

الآن ، أضف 25 ميكرولترا من جزيئات الذهب إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، ودوامة لمدة 10 ثوان. أضف 10 ميكرولتر من 25.46 ملليغرام لكل لتر من سبيرميدين ودوامة لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد ، والدوامة لمدة ثلاث دقائق.

أخيرا ، أضف 25 ميكرولترا من 277.5 ملليغرام لكل لتر من محلول كلوريد الكالسيوم ، ودوامة لمدة دقيقة واحدة. قم بتدوير الناقلات الصغيرة الذهبية باستخدام جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة خمس ثوان. بعد الطرد المركزي ، قم بإخراجه بعناية من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

بعد ذلك ، اغسل الحبيبات ب 200 ميكرولتر من الإيثانول المطلق ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق الدوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان. بمجرد الكسب ، قم بتدوير الناقلات الدقيقة للذهب بأقصى سرعة لمدة خمس ثوان ، وقم بإزالة الإيثانول. أعد تعليق جزيئات الذهب في 18 ميكرولتر من الإيثانول المطلق.

بعد ذلك ، قم بنقل ستة ميكرولترات من تعليق الجسيمات في منتصف ثلاث ناقلات دقيقة واتركها تجف في الهواء. لنقل الحمض النووي إلى الخلايا والنباتات عن طريق قصف الجسيمات ، قم أولا بتعيين نظام توصيل الجسيمات كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قصف الخلايا أو النباتات على الصفيحة الزراعية لثلاث مرات في ثلاثة أوضاع مختلفة.

احتفظ بالخلايا والنباتات التي تعرضت للقصف في الظلام في غرفة نمو النبات لمدة ست إلى 72 ساعة قبل ملاحظة إشارات الفلورسنت. اضبط غرفة نمو النبات على 24 ساعة مظلمة و 22 درجة مئوية. انقل النباتات الصغيرة أو الخلايا المعلقة إلى شريحة زجاجية تقليدية وضع شريحة غطاء برفق في الأعلى للتصوير بواسطة الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر القياسي.

باستخدام الإعدادات المدرجة في بروتوكول النص ، قم بإثارة البروتينات الموسومة ب GFP عند 485 نانومتر ، واكتشف التألق عند 525 نانومتر. بالنسبة للبروتينات الموسومة ب RFP ، قم بالإثارة عند 585 نانومتر واكتشفها عند 608 نانومتر. أخيرا ، احسب نسبة التجميعية لإشارات الفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص.

تم تحقيق التعبير المشترك عن الأرابيدوبسيس VSR-2 و arabidopsis SCAMP4 في خلايا التبغ BY-2 عن طريق قصف الجسيمات وإظهار التوطين الصحيح. يعرض RFP arabidopsis VSR-2 نمطا ثقبا ، والذي كان مختلفا عن توطين غشاء البلازما ل arabidopsis SCAMP4-GFP ، مع بعض نقاط البزل العصاري الخلوي. علاوة على ذلك ، تم إنشاء النباتات المعدلة وراثيا الأرابيدوبسيس التي تشارك في التعبير عن أرابيدوبسيس SCAMP4-GFP و RFP arabidopsis VSR-2 عن طريق التحول بوساطة البكتيريا الزراعية.

يتم عرض التوطين الخلوي للتعبير المشترك عن البروتينين الخيمري في خلايا شعر الجذر والجذر. تمشيا مع الدراسات السابقة ، تسبب علاج الأرابيدوبسيس المعدل وراثيا في مقصورات ما قبل التفريغ المسماة RFP parabidopsis VSR-2 ، مما يشكل بنية صغيرة تشبه الحلقة. في حين أن العلاج باستخدام prefoldin A المستحث arabidopsis SCAMP GFP يسمى تجميع شبكة G عبر الذهب.

كعنصر تحكم سلبي ، لوحظ القليل من إشارة الفلورسنت الذاتي في خلايا التبغ BY-2 وخلايا شعر جذر وجذور الأرابيدوبسيس من خلال تطبيق نفس إعدادات جمع الصور. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على التوطين الخلوي للبروتينات. يمكن أيضا تطبيقه على دراسة البروتين في الاتجاه.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا النباتية. لتصدير التوطين تحت الخلوي والتفاعل المكاني للبروتينات في الخلية النباتية الحية بشكل ملائم. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحول بوساطة PET والعبور الجيني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية التعبير المشترك عن العديد من بروتينات الاندماج في النباتات.

لا تنس أن العمل مع القصف يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل واقيات العين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.