Multimer-PAGE لفصل مجمعات البروتين الأصلية: تقنية فصل هجينة تتكون من Blue Native-PAGE و SDS-PAGE لفصل البروتينات متعددة المستويات السليمة عن محللة الأنسجة

مجمعات البروتين Multimeric ضرورية لمختلف العمليات البيولوجية.

لفصل مجمعات البروتين في حالتها الأصلية بواسطة multimer-PAGE ، خذ محللة الأنسجة التي تحتوي على المجمعات المرغوبة. قم بتحميل المحللة على مجموعة هلام ل Blue native PAGE.

املأ النظام بمخزن مؤقت قلوي يحتوي على صبغة أنيونية زرقاء وقم بتوصيله بمصدر الطاقة. عند درجة الحموضة القلوية ، ترتبط جزيئات الصبغة بمركب البروتين مما يضفي عليه شحنة سالبة إجمالية دون تغيير الطبيعة. ينتقل مركب البروتين السليم سالب الشحنة عبر الجل كشريط أزرق.

بعد الحد الأدنى من التشغيل ، والسماح للبروتين السليم بالهجرة إلى هلام الحل ، قم باستئصال الشريط الذي يحتوي على المركب. احتضان الشريط في محلول يحتوي على عامل ربط متقاطع للسماح لمجموعاته التفاعلية بالتفاعل مع مجموعات الأمين للبروتين القريب ، مما يؤدي إلى استقرار المركب متعدد الفرصة.

استبدل محلول الربط المتقاطع بكاشف التبريد لتهدئة نشاط الروابط المتقاطعة غير المتفاعلة. أضف SDS - منظف أنيوني - يضفي شحنة سالبة موحدة على مركب البروتين السليم مع الحفاظ على حجمه الأصلي ومكياجه.

ضع الشريط المعالج في كاسيت جديد وأعد صبه في جل SDS-PAGE جديد. أثناء الرحلان الكهربائي ، ينتقل مركب البروتين المتقاطع سالب الشحنة نحو الأنود الموجب ويظهر كشريط عالي الوزن الجزيئي في الجل.

لبدء هذا الإجراء ، استعد للرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق ، كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة ، وقم بالكهرباء للبروتينات الموجودة في الجل عند 150 فولت ، حتى يتقدم شريط الصبغة حوالي 2 سم في طبقة الحل. في هذه المرحلة ، أوقف مصدر الطاقة وافصله.

بعد تفكيك جهاز الرحلان الكهربائي ، افصل الألواح الزجاجية لشريط الجل. قم بإزالة طبقة التراص وتجاهلها.

قم بقص الجل بعناية ، أسفل الحافة السفلية لواجهة الصبغة مباشرة ، مع الحرص على جعل هذا القطع سلسا ومستقيما قدر الإمكان. ثم تخلص من قطعة الجل غير المستخدمة. قم بقص أي أجزاء غير مستخدمة على طول حواف شريط الجل.

ضع الشريط بحذر في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في وعاء صغير ، واخلطه برفق عن طريق التعويذة لمدة 30 دقيقة حتى يتوازن. بعد التوازن ، تخلص من PBS واستبدله ب 10 ملليلتر أخرى.

ماصة 500 ميكرولتر من 25 مللي مولار DSP مذابة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد في PBS وتستمر في الخلط كما كان من قبل ، لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، اسكب محلول DSP. أضف 10 ملليلتر من 0.375 مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.8 ، تحتوي على 2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، لإخماد DSP غير المتفاعل. استمر في التعويذة لمدة 15 دقيقة.

شريط الجل ، قم بإعداد محاليل جل SDS-PAGE وفقا للطرق القياسية. لا تضيف كواشف البلمرة. بعد التبريد ، أعد شريط الجل الأصلي الأزرق إلى درجة حرارة الغرفة وقم بصب الشريط في شريط جل جديد.

للقيام بذلك ، التقط الجل بعناية وضعه على لوحة فاصل كاسيت هلام نظيفة. قم بتوجيه الشريط بحيث يتم قلبه من اتجاهه السابق ، ويكون الجزء السفلي من واجهة الصبغة هو الأقرب إلى الجزء العلوي من الكاسيت الجديد.

ضع الشريط بحيث تكون حافته العلوية حتى مع مكان الحافة العلوية للوحة الغطاء. تأكد من أن واجهة الصبغة موازية للحواف الأفقية للوحة الزجاجية. ادفع جانبا واحدا من الشريط المقطوع على أحد جدران الفاصل ، مع ترك مساحة على الجانب الآخر لسكب الجل ، وتحميل معيار بروتين أو سلم. إذا كانت الحافة السفلية لشريط الجل تحتوي على أي مناطق خشنة أو غير مستوية ، فقم بقصها بعناية.

بمجرد وضع شريط الجل بشكل صحيح ، ضع لوحة الغطاء فوق لوحة الفاصل. استخدم ضغطا برفق لدفع أي فقاعات هواء محاصرة. استمر في تجميع جهاز صب الهلام ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

يتحول شريط الجل أحيانا عند وضع اللوحة العلوية. من المفيد ترك الشريط يتدلى على حافة اللوحة العلوية قليلا ، بحيث يمكن تعديله باستخدام ملعقة لتصحيح أي تحولات.

أضف كواشف البلمرة إلى المخزن المؤقت للهلام المحلل ، واسكبه في كاسيت الجل المحضر باستخدام ماصة مصلية. املأ علبة الجل إلى حوالي 2 سم أسفل شريط جل PAGE الأصلي الأزرق المقطوع لإفساح المجال لطبقة التكديس. ثم أضف 100 ميكرولتر من البيوتانول فوق الجزء العلوي من الجل المصبوب ، واترك 30 دقيقة لبلمرة طبقة الانحلال قبل سكب البيوتانول.

بعد ذلك ، أضف كواشف البلمرة إلى محلول هلام التكديس. باستخدام ماصة مصلية ، اسكب طبقة التكديس لملء جميع الفراغات الفارغة المتبقية في علبة الجل. قم بإمالة كاسيت الجل أثناء سكب طبقة التكديس ، بحيث تملأ الفراغ أسفل شريط الجل ولا يتم احتجاز فقاعات الهواء.

نظرا لأن المخزن المؤقت لجل التكديس يملأ المساحة الفارغة أسفل شريط الجل ، أعد علبة الجل تدريجيا إلى مستوى القدم. استمر في ملء المساحة الفارغة بجوار شريط الجل المستأصل بمحلول جل التكديس ، حتى يفيض تقريبا. ثم اترك طبقة التكديس تتبلمر لمدة 30 دقيقة.

بعد بلمرة طبقة التكديس ، قم بإزالة كاسيت الجل من جهاز الصب ، واشطفه بالماء المقطر ، وقم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

املأ الغرفة الداخلية بالكامل بمخزن مؤقت قيد التشغيل 1X SDS-PAGE. ثم املأ الغرفة الخارجية إلى المستوى الذي حددته الشركة المصنعة. قم بتحميل المساحة المجاورة لشريط الجل المقطوع بسلم الوزن الجزيئي أو معيار البروتين المناسب.

قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة وقم بتفريغ العينات بالكهرباء عند 120 فولت. عندما تنفد صبغة Coomassie من الجل ، أوقف التشغيل وافصل مصدر الطاقة. قم بتحليل الجل باستخدام الطرق القياسية للنشاف الكهربائي والكشف عن البروتين القائم على الأجسام المضادة.