سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في تكوين مجمعات البروتين التي تتجمع على وجه التحديد حول زوج من البروتينات المتفاعلة ذات الأهمية باستخدام تقسيم BioID ، وهو اختبار تكميل شظايا البروتين الذي يحفز بيوتينيل البروتين المعتمد على القرب داخل الخلايا الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية مثل كيفية إعادة تشكيل مجمعات البروتين ديناميكيا لتنظيم الوظائف الخلوية المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بسهولة التعرف على مجمعات البروتين الخاصة بالسياق في بيئاتها الخلوية الأصلية وبدقة عالية جدا.

بالنسبة للتحليل الطيفي الكتلي النهائي ، يجب تنفيذ الخطوات التالية في ظروف خالية من الكيراتين ويجب أن تكون جميع المواد والكواشف خالية من الكيراتين قدر الإمكان. بعد استنساخ ORFs لبروتينين مهمين في بلازميد BioID المنقسم ، وإجراء تعداء عابر ثم إضافة وسط مكمل بالبيوتين وفقا لبروتوكول النص ، استخدم PBS لغسل الخلايا مرتين. أضف 1.5 مل من PBS إلى كل لوحة واستخدم مكشطة لحصاد الخلايا ، ثم انقل الخلايا لكل حالة إلى أنبوب منفصل سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الأنابيب عند 1،200 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المواد الطافية وقم بتجميد الكريات في النيتروجين السائل. ثم قم بتخزين الأنابيب عند سالب 80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. لتحضير محللات الخلية ، استخدم ملليلترا واحدا من محلول تحلل RT لإعادة تعليق الكريات.

ثم مرر الخلايا عبر إبرة قياس 25 من 10 إلى 20 مرة. بعد ذلك صوتنة العينات. ثم أضف 100 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 لكل 900 ميكرولتر من محللة صوتنة المستردة للتركيز النهائي 2٪ أضف 2.3 مل من 50 ملليمولار تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، لكل مليلتر من المحللة لضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملليمولار للارتباط بخرز الستربتافيدين.

ثم قم بتوزيع المحللات المعدلة في أنابيب سعة 1.5 مليلتر وقم بطردها عند 16 ، 000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق. انقل المواد الطافية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر واحتفظ ب 50 إلى 100 ميكرولتر كمادة إدخال. لإجراء سحب الستربتافيدين ، لكل حالة ، قم بنقل 200 ميكرولتر من تعليق الخرزة المغناطيسية المقترنة بالستربتافيدين إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وانتظر دقيقة واحدة تقريبا قبل إزالة مخزن التخزين المؤقت. باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتوازن ، اغسل الخرزات عن طريق الخلط برفق. ثم أرسل الخرزات المتوازنة بالتساوي في العدد اللازم من الأنابيب وضعها مرة أخرى على الرف المغناطيسي.

بعد إزالة المخزن المؤقت للتوازن، أعد تعليق كل مجموعة من الخرزات بكميات متساوية من محللات الخلية المقابلة. ثم احتضان العينات عند أربع درجات مئوية على عجلة دوارة طوال الليل. في اليوم التالي ضع الأنابيب على رف مغناطيسي.

انتظر حتى تلتصق الخرزات بجانب الأنابيب وانقل المواد الطافية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يسمى التدفق من خلاله. مع 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازل واحد ، قم بتعليق الخرزات في كل أنبوب واجمع كل مجموعة من الخرزات المعلقة المقابلة لحالة واحدة في أنابيب 1.5 ملليلتر. استخدم ملليلترا واحدا من مخزن الغسيل لغسل الخرزات مرتين على عجلة دوارة لمدة ثماني دقائق.

ثم قم بإجراء غسلتين لكل من مخازن الغسيل الثانية والثالثة والأربعة. للتأكد من التخلص من المخزن المؤقت للغسيل تماما بعد خطوة الغسيل الأخيرة ، بعد إزالة معظم المادة الطافية ، قم بتدوير العينات. ثم ضعها مرة أخرى على الرف المغناطيسي وقم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي.

أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف إلى الخرزات ثم احتضن العينات عند 98 درجة مئوية لمدة خمس عشرة دقيقة وانقل الأنابيب على الفور إلى الرف المغناطيسي. انقل العينة المملوثة إلى أنبوب جديد وقم بتخزين الأنابيب عند سالب 20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. لكل عينة إدخال ، قم بإعداد عينة PAGE عن طريق خلط كميات متساوية من البروتين بالحجم المناسب من المخزن المؤقت لتحميل 3X SDS بحجم إجمالي قدره 28 ميكرولترا.

ثم قم بإعداد عينات PAGE عن طريق خلط خمسة ميكرولترات من كل عينة شطف مع 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 3X SDS. قم بتحميل العينات على جل بولي أكريلاميد SDS. ثم انتقل إلى الرحلان الكهربائي والنشاف الغربي وفقا لبروتوكول النص.

لإجراء SDS-PAGE لتحليل MS ، أضف 6.25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 4X إلى 18.75 ميكرولتر من كل عينة شطف وقم بتشغيل العينات على هلام SDS مسبقة الصب من أربعة إلى 20٪ حتى تهاجر من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في الجل. في طبق بتري بطول 15 سم ، قم بتلطيخ الجل بصبغة Coomassie Brilliant Blue G250 الغروية. استخدم مشرطا نظيفا لاستئصال الممرات بأكملها لكل عينة ، باستثناء شريط الستربتافيدين ، ونقل النطاقات المقطوعة إلى أنابيب 1.5 ملليلتر لتحليل MS.

بالإضافة إلى البروتينات الحيوية الداخلية التي تم تحديدها في تجربة BioID ، وتجربة BioID المنقسمة ، فإن النطاقات الرئيسية الإضافية التي لاحظتها اللطخة الغربية هي بروتينات الاندماج التي تنشط ذاتيا ، مما يشير إلى أن البروتينين المختبرين ، في هذا المثال Ago2 و TNRC6C أو Ago2 و Dicer تفاعلا في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تشير نتائج اللطخة الغربية إلى أن وجود بروتين اندماج NBirA * Ago2 مقترن باندماج CBirA * إلى TNRC6C أو Dicer أكثر كفاءة من المجموعات المعاكسة التي يتم فيها إقران CBirA * Ago2 باندماجات NBirA * للبروتينين الآخرين. علاوة على ذلك ، كان التنشيط محددا ، حيث لم يتمكن أي من اندماجات CBirA * من تنشيط بروتين اندماج التحكم NBirA * GFP إلى مستويات ملحوظة.

عند إجراء العزل لأول مرة ، يجب تحليل جميع خطوات التنقية عن طريق النشاف الغربي. كما هو موضح هنا ، يجب أن يكون الارتباط بالخرز كميا تقريبا ولا ينبغي ملاحظة أي تسرب تقريبا في الغسيل. عندما يتم تشغيل المادة المملوءة على جل ملطخ ب Coomassie بعد التعبير عن البروتين والبيوتينيل المستحث ، فإن أقوى نطاق لوحظ يعمل عند حوالي 17 كيلودالتون ويتوافق مع الستربتافيدين الأحادي.

عادة ما يتم استئصال مساحة حارة العينة فوق شريط الستربتافيدين أعلى بئر التحميل لتحليل MS. أثناء تطبيق هذا الإجراء على بروتينين معينين ، من المهم اختبار مجموعة مختلفة من بروتينات الاندماج. في الواقع ، لاحظنا في كثير من الأحيان أن كفاءة البيوتينيل الإجمالية يمكن أن تعتمد بشكل وثيق على البروتين الذي يتم إلحاقه بشظايا BirA الطرفية N أو C.

من المهم بنفس القدر إضافة تجربة واحدة على الأقل لتقسيم BioID للتحكم السلبي. على سبيل المثال ، على زوج من البروتينات المتفاعلة التي لا ترتبط بزوج البروتين محل الاهتمام. باتباع هذا الإجراء وقياس الطيف الكتلي ، يجب تطبيق التحليل الحسابي لتسجيل الببتيدات المحددة مقابل تجارب التحكم السلبية.

نحن نستخدم ، على سبيل المثال ، برنامج MaxQuant و Perseus الذي طورته مختبرات Cox and Mann في ميونيخ ، ألمانيا.