متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية
May 5th, 2017
وتقدم (PAGE) نظام طريقة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من المحللة أنسجة معدلة باستخدام بروتين عبر رابط-أمين رد الفعل مضافا إلى رواية اثنين من الأبعاد هلام بولي أكريلاميد الكهربائي.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو تمكين الباحثين من التقاط وفصل وتحليل مجمعات البروتين الأصلية المستخرجة من محللات الأنسجة باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين الذين يدرسون البروتينات لأنها قادرة على تثبيت ارتباطات البروتين المتقلب في ظل ظروف شبه أصلية ، مما يسمح بتحديدها وتحليلها لاحقا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم طرقا بيولوجية شائعة ، لذا فهي قابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن تخصيصها وفقا لأهداف الباحث الفردي.
لبدء هذا الإجراء ، استعد للرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة وقم بالكهرباء للبروتينات الموجودة في الجل عند 150 فولت حتى يتقدم نطاق الصبغة حوالي سنتيمترين في طبقة الحل. في هذه المرحلة ، أوقف مصدر الطاقة وافصله.
بعد تفكيك جهاز الرحلان الكهربائي ، افصل الألواح الزجاجية لشريط الجل. قم بإزالة طبقة التراص وتجاهلها. قم بقص الجل بعناية أسفل الحافة السفلية لواجهة الصبغة مباشرة ، مع الحرص على جعل هذا القطع سلسا ومستقيما قدر الإمكان.
ثم تخلص من قطعة الجل غير المستخدمة. قم بقص أي أجزاء غير مستخدمة على طول حواف شريط الجل. ضع الشريط بحذر في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في وعاء صغير واخلطه برفق عن طريق التدوين لمدة 30 دقيقة حتى يتوازن.
بعد التوازن ، تخلص من PBS واستبدله ب 10 ملليلتر أخرى. ماصة 500 ميكرولتر من 25 مللي مولار DSP مذابة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد في PBS وتستمر في الخلط كما كان من قبل لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، اسكب محلول DSP.
عند 10 ملليلتر من 0.375 مولار HSCL ، الرقم الهيدروجيني 8.8 ، يحتوي على 2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم لإخماد DSP غير المتفاعل. استمر في التدوين لمدة 15 دقيقة. أثناء تبريد شريط الجل ، قم بإعداد محاليل جل SDS-PAGE وفقا للطرق القياسية.
لا تضيف كواشف البلمرة. بعد التبريد ، أعد شريط الجل الأصلي الأزرق إلى درجة حرارة الغرفة وقم بصب الشريط في شريط جل جديد. للقيام بذلك ، التقط الجل بعناية وضعه على لوحة فاصل كاسيت هلام نظيفة.
قم بتوجيه الشريط بحيث يتم قلبه من اتجاهه السابق ويكون الجزء السفلي من واجهة الصبغة أقرب إلى الجزء العلوي من الكاسيت الجديد. ضع الشريط بحيث تكون حافته العلوية حتى مع مكان الحافة العلوية للوحة الغطاء. تأكد من أن واجهة الصبغة موازية للحواف الأفقية للوحة الزجاجية.
ادفع جانبا واحدا من الشريط المقطوع على أحد جدران الفاصل ، مع ترك مساحة على الجانب الآخر لسكب الجل وتحميل معيار البروتين أو السلم. إذا كانت الحافة السفلية لشريط الجل تحتوي على أي مناطق خشنة أو غير مستوية ، فقم بقصها بعناية. بمجرد وضع شريط الجل بشكل صحيح ، ضع لوحة الغطاء فوق لوحة الفاصل.
استخدم ضغطا برفق لدفع أي فقاعات هواء محاصرة. استمر في تجميع جهاز صب الهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يتحول شريط الجل أحيانا عند وضع اللوحة العلوية.
من المفيد ترك الشريط يتدلى على حافة اللوحة العلوية قليلا حتى يمكن تعديله بملعقة لتصحيح أي تحولات. أضف كواشف البلمرة إلى المخزن المؤقت للهلام المحلل واسكبه في كاسيت الجل المحضر باستخدام ماصة مصلية. املأ كاسيت الجل إلى حوالي سنتيمترين أسفل شريط جل PAGE الأصلي الأزرق المقطوع لترك مساحة لطبقة التكديس.
ثم أضف 100 ميكرولتر من البيوتانول فوق الجزء العلوي من الجل المصبوب واترك 30 دقيقة لبلمرة طبقة الانحلال قبل سكب البيوتانول. بعد ذلك ، أضف كواشف البلمرة إلى محلول هلام التكديس. باستخدام ماصة مصلية ، اسكب طبقة التكديس لملء كل المساحة الفارغة المتبقية في علبة الجل.
قم بإمالة علبة الجل أثناء سكب طبقة التكديس بحيث تملأ الفراغ أسفل شريط الجل ولا يتم احتجاز فقاعات الهواء. نظرا لأن المخزن المؤقت لجل التكديس يملأ المساحة الفارغة أسفل شريط الجل ، أعد علبة الجل تدريجيا إلى مستوى القدم. استمر في ملء المساحة الفارغة بجوار شريط الجل المستأصل بمخزن جل التكديس حتى يفيض تقريبا.
ثم اترك طبقة التكديس تتبلمر لمدة 30 دقيقة. بعد بلمرة طبقة التكديس ، قم بإزالة كاسيت الجل من جهاز الصب ، واشطفه بالماء المقطر ، وقم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. املأ الغرفة الداخلية بالكامل بمخزن مؤقت للتشغيل 1x SDS-PAGE.
ثم املأ الغرفة الخارجية إلى المستوى الذي حددته الشركة المصنعة. قم بتحميل المساحة المجاورة لشريط الجل المقطوع بسلم الوزن الجزيئي أو معيار البروتين المناسب. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة وقم بتفريغ العينات بالكهرباء عند 120 فولت.
عندما تنفد صبغة Coomassie من الجل ، أوقف التشغيل وافصل مصدر الطاقة. قم بتحليل الجل باستخدام الطرق القياسية للنشاف الكهربائي والكشف عن البروتين القائم على الأجسام المضادة. يظهر التحقق من صحة multimer-PAGE هنا عبر اللطخة المناعية.
يتم شق مركب كينيسين الذي تم التقاطه بواسطة diphyo-3-itol مما يدل على أن المجاميع ذات الوزن الجزيئي العالي تتشكل عن طريق الربط المتقاطع بين البدائل الأصغر. كما تم تصويره هنا ، حيث زاد محللات الدماغ المعالجة بتركيزات متزايدة من SDS أو Triton من اكتشاف ألفا سينوكلين أحادي مع تقليل اكتشاف رباعي القلة القابل للذوبان. هنا ، يتم عرض النتائج التمثيلية ل multimer-PAGE المستخدمة لالتقاط المجمعات القابلة للذوبان في محللة دماغ الفئران.
تم الكشف عن البروتينات عن طريق اللطخة المناعية. يظهر الوزن الأحادي المتوقع لكل بروتين أسفل الممرات. وبالمثل ، يظهر هنا التقاط المجمعات المرتبطة بالغشاء.
يفشل Multimer-PAGE أحيانا في التقاط مركب ، كما هو موضح في مركب SDHA التنفسي لطخة اثنتين. يمكن العثور على مناقشة للتفسيرات المحتملة لذلك في بروتوكول النص. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الربط المتقاطع داخل الهلام لمجمعات البروتين الأصلية متبوعا بإعادة صب الهلام وفصله بواسطة SDS-PAGE الثانوي. لا تنس أن العمل مع مادة الأكريلاميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء صب الجل. بعد هذا الإجراء ، يمكن شطف المجمعات المستقرة المنفصلة أو قطعها من الجل ويمكن تحليلها بعدة وسائل ، بما في ذلك الكشف عن المناعة أو قياس الطيف الكتلي حسب احتياجات الباحث.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتثبيت وفصل المجمعات البروتينية الأصلية من المستحلبات النسيجية باستخدام نظام كهربائي هلامي جديد ثنائي الأبعاد (PAGE). يسمح بتحليل تفاعلات البروتين في ظروف قريبة من الطبيعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- بروتيوميات
- الكهربائي
الخلفية
- فهم المجمعات البروتينية أمر بالغ الأهمية للعديد من الدراسات البيولوجية.
- يمكن أن تكون تفاعلات البروتينات الأصلية غير مستقرة وصعبة التحليل.
- تسهل الطرق البيولوجية الشائعة تطبيق هذه التقنية.
- تسمح هذه الطريقة بمقاربات مخصصة لتحليل البروتين.
هدف الدراسة
- لتقاط وتحليل المجمعات البروتينية الأصلية من المستحلبات النسيجية.
- لتثبيت تفاعلات البروتين لتحسين التعرف عليها.
- لتوفير طريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للباحثين.
الطرق المستخدمة
- التحضير للهلام الكهربائي الأزرق الأصلي لبولي أكريلاميد.
- الكهربائي للبروتينات عند 150 فولت.
- مراقبة تقدم نطاق الصبغة في الهلام.
- استخدام متصالب بروتين تفاعلي مع الأمينات.
النتائج الرئيسية
- تثبيت ناجح للمجمعات البروتينية الأصلية.
- فصل فعال للبروتينات في المستحلبات النسيجية.
- تحديد تفاعلات البروتين في ظروف قريبة من الطبيعية.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الطريقة تحليل المجمعات البروتينية.
- إنها قابلة للتكيف مع أهداف بحثية مختلفة.
- استخدام طرق شائعة يزيد من سهولة الوصول للباحثين.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
