في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة ومقارنة حركية التجميع لأنواع بروتين تاو غير المعدلة وفرط الفسفرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد بروتين تاو غير معدل وفرط الفسفرة أولا بواسطة نظام المحفز بمساعدة السحابات. الخطوة الثانية هي إعداد فحوصات التجميع لتكون مناسبة لأي من أداتين مختلفتين.

تتم مراقبة عملية تجميع تاو من خلال مضان اثنين من ثيو مختلفين. يموت فلافين ، من فلافين S ومن فلافين T.الخطوة الأخيرة هي رسم ومقارنة منحنيات التجميع. في النهاية ، يتم استخدام التغييرات الحركية لمضان الفلافين من الارتباط إلى أنواع TA المجمعة لإظهار التعزيز المعتمد على فرط الفسفرة لرجفان تاو في المختبر.

مرحبا ، مرحبا بكم في مقالنا JOV. فحوصات التجميع في المختبر باستخدام بروتين فرط فوسفو تاو. اسمي مينكو ، وسيتم إجراء التجارب وإظهارها عن طريق الطريق.

وبالنسبة لهذا البروتوكول ، تم إجراء مخزن مؤقت تجميع جديد بشكل معقول خلال الشهر الماضي. قبل استخدامه مباشرة ، أضف DIO ثلاثة إيتول إلى مليمولار واحد يتطلب أيضا شاي ثيو فلافين مفلتر أو محلول مخزون S. محلول مخزون Hein ، كلاهما قابل للتخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر وبروتين منشفة مخزن عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

اسحب المنشفة على الثلج ، ثم اضبط تركيزها باستخدام مخزن التجميع المؤقتة كما هو مطلوب لتحقيق الاتساق. قم بتدوير المنشفة باستخدام مخزن مؤقت للتجميع و 20 ، 800 جم لمدة 10 دقائق من أربع درجات مئوية. الآن انقل supinate إلى أنبوب آخر واحتفظ به على الجليد حتى يحين وقت تجميع تفاعل التجميع.

قم بإعداد خليط التجميع في أنابيب مركزية دقيقة سعة 1.5 مل. وفقا للجدول ، يكفي 100 ميكرولتر لحصة واحدة من المواد المتفاعلة. احسب الحجم الإجمالي بناء على عدد التفاعلات وزيادته بنسبة 10٪ لحساب أخطاء سحب العينات.

يمكن استبدال الفلفل بحمض الراونيك أو مخزن التجميع إذا لزم الأمر. امزج التفاعلات عن طريق الانعكاس وانقلها إلى 37 درجة مئوية بدون نباتات. بعد كل 24 ساعة ، قم بتجديد التفاعلات بكمية إضافية واحدة من DTT لضمان بيئة مختزلة لقياس التألق.

قم بتسخين مقياس الفلور الطيفي لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى تحسين اتساق القياسات في برامج الكمبيوتر. حدد وضع العرض في الوقت الفعلي الموجود في مركز التحكم في أجهزة القياس.

اضبط الطول الموجي للإثارة على 450 نانومتر مع وجود الشق عند نانومترين واضبط الطول الموجي للانبعاث على 510 نانومتر مع شق خمسة نانومتر. ثم ارجع إلى مركز التحكم في الجهاز واختر تحليل الطول الموجي الثابت. اضغط على مفتاح الإضافة في الإطار العلوي لإضافة مجموعة من الأطوال الموجية.

اضبط معلمات الاستحواذ على الخطأ المعياري إلى واحد والحد الأقصى للتجارب على ثلاثة. ثم انقر فوق إضافة. بعد ذلك ، انقر فوق "انتقال" لفتح نافذة عرض البيانات.

الآن في نافذة عرض البيانات ، انقر فوق بدء العمل لفتح مربع حوار العينة الجديد واختر غير معروف لنوع العينة. ثم قم بإعداد التفاعلات لأخذ القياسات لكل 100 ميكرولتر عند 98. ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجميع ، وميكرولترين من ثلاثة مللي مولار من ماصة الفلافين S أو T الخليط عدة مرات لضمان الخلط الجيد.

انقل كل 200 ميكرولتر من خليط واحد إلى FA ثلاثة qve وقم بتحميله في موضعه. ثم لعق الجري لجمع بيانات التألق بعد إزالة المحلول من vete ، اشطفه ثلاث مرات بالماء المقطر وجففه في تيار هواء. يتضمن هذا الاختبار صبغة الفلورسنت في تفاعل الأيون ، والتي تسمح بقياسات مستمرة ويتم إجراؤها بشكل أفضل باستخدام قارئ لوحة بئر حصيرة أوتوماتيكي.

المعلمة العادية أيضا على سرعة التشغيل اليدوي. قم بإعداد مزيج التجميع في صفيحة سوداء معتمة سعة 96 جيدا. مع 360 ميكرولتر حجم بئر 200 ميكرولتر يكفي لكل نقطة زمنية قياس.

امزج كل تفاعل جيدا مع سحب العينات. احتضان لوحة 96 بئر عند 37 درجة مئوية وكل 24 ساعة أضف مللي مولر إضافي واحد من DTT لضمان بيئة مختزلة في كل نقطة زمنية. للقياس ، قم بتشغيل قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع والكمبيوتر قبل 10 دقائق على الأقل في برنامج الكمبيوتر.

اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وحدد وضع شدة التألق. ثم اضبط الطول الموجي للإثارة على 450 نانومتر والطول الموجي للانبعاث على خمسة و 10 نانومتر. أدخل لوحة البئر 96 في السحب واضغط على مفتاح القراءة.

بعد أخذ القياسات ، أعد اللوحة على الفور إلى الحاضنة قبل تحليل البيانات ، ويمكن إجراء اختبار الوضع المستمر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المضغوط لهذا الفحص. قم بإعداد خليط التجميع في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. 200 تفاعل ميكرولتر كافية لقياس نقطة زمنية.

اقلب الأنابيب للخلط. قم بإعداد التفاعلات عند 37 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة وأضف ملليمولر إضافي واحد من DTT كل 24 ساعة لأخذ القياسات. قم بإعداد مقياس المسالك البولي والبرنامج كما هو الحال بالنسبة لمقايسة المحطة الطرفية بدون قالب.

انقل الخليط بالكامل إلى طبيب بيطري وضعه في حامل العينة في حجرة العينة وأغلق الغطاء. انقر فوق تشغيل لتجميع بيانات التألق في الفترات الزمنية المناسبة. إذا كان هذا الفاصل الزمني قصيرا ، مثل 30 أو 60 ثانية ، فلا بأس من ترك الطبيب البيطري Q في الجهاز بين القياسات حتى يتم الوصول إلى آخر نقطة زمنية.

أعد التفاعل من vete إلى أنبوب العينة الخاص به وأعد الأنبوب إلى الحاضنة عند الانتهاء. هين على vete كما هو موضح سابقا باستخدام تاو المؤتلف و P tal. تم إنشاء بروتوكولين مختلفين لمقارنة حركية تجميع تاو و p tal ، مع الاستفادة من الانبعاث الفلوري القوي لمركبات الفلافين t و s عند الارتباط بمجاميع بروتين الأميلويد ، بما في ذلك tau و p tal ، مع أو بدون صبغة الفلورسنت.

في تفاعل التجميع ، كان هناك تعزيز ثابت لتجميع تاو عن طريق فرط الفسفرة. عادة ما ترتفع T و p tal liga بسرعة خلال أول 30 دقيقة قبل تباطؤ الأهمية ، بما في ذلكمن الفلافين. تسبب T في تفاعلات التجميع تخلفا كبيرا في معدل التجميع.

اقترب كل من Theof Flavian s و t من الهضبة بعد رد فعل لمدة 160 دقيقة. من ناحية أخرى ، لم يتسبب الفلافين الحيوي في تباطؤ ملحوظ في التجميع. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء الجهاز العصبي المركزي الإضافي للأشكال الإسوية أو البروتينات الأخرى المعرضة للتراكم في التنكس العصبي ، مثل المثل باستخدام الفحص من أجل فهم مساهمة تكوين البروتين في التسبب في التسبب بعد تطوره.

هذه التقنية لإعداد طريقة بروتين عالي الفوسفات للبحث في هذا المجال ، والعديد من الأمراض لاستكشاف علاجاتنا وتطوير الأدوية.