التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

يصف لنا طريقة للتحديد الكمي لتجميع البروتينات تجمعات. لدينا تفاصيل البروتوكول لينتيفيرال الناجمة عن توليد خط الخلية مستقرة والتصوير الآلي [كنفوكل]، وتحليل الصور من المجاميع البروتين. كتطبيق توضيحية، قمنا بدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة في تشجيع تجميع SOD1 بطريقة تعتمد على وقت وجرعة.

الهدف العام من هذه التجربة هو تطوير اختبار لدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة في تعديل تجميع البروتينات غير المطوية بطريقة تعتمد على الوقت والجرعة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لتطوير الفحص الخلوي ، واستخدامها لتقنيات الفحص عالية المحتوى. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في توفير طريقة بسيطة لاكتشاف وتحديد تراكم البروتين الذي يحدث في العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى العلاج المحتمل للأمراض التنكسية العصبية ، مثل التصلب الجانبي الضموري ، لأنها تقترح طريقة بسيطة تسمح بتطوير الفحص الخلوي وإجراء فحص لوسطاء الجزيئات الصغيرة. لبدء إنتاج الفيروس ، قبل تعداء البلازميد ، قم بتقسيم الخلايا التائية HEK-293 عند التقاء 30 إلى 40٪ في طبق زراعة أنسجة 10 سم و 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا. احتضان صفيحة الاستزراع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بإعداد محلول تعداء الحمض النووي مع تغليف البلازميدات ناقلات الفيروسات العدسية ، 125 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي الواحد وأضف الماء المقطر لضبط الحجم إلى 500 ميكرولتر. أضف برفق 500 ميكرولتر من عازلة HEPS 0.05 مولار واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استبدل وسط الخلية التائية HEK-293 ب 10 ملليلتر وسط ثقافة طازج خال من المضادات الحيوية مخلوة مسبقا ممزوجا بمليلتر واحد من محلول تعداء الحمض النووي.

احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. استبدل المادة الطافية للخلية بوسط مزرعة طازجة في اليوم التالي واحتضانها مرة أخرى طوال الليل. أخيرا ، في اليوم التالي ، قم بحصاد المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل.

لإزالة الخلايا الميتة والحطام ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق. لمزيد من تنقية supernatent ، قم بتمريره عبر مرشح 0.45 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 60 مل. بعد ذلك ، قم على الفور بتوزيع المادة الطافية المفلترة إلى 300 ميكرولتر من الحصص ذات الاستخدام الواحد.

لتحضير الخلايا للتنبيغ ، قم بتقسيمها لتصاب بالعدوى عند التقاء 60٪ في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار في ملليلترين من DMAM مكملة بنسبة 10٪ FBS. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإذابة جزء واحد من فيروس العدسات المجمد على الجليد لكل استخدام.

وفي الوقت نفسه ، قم بتسخين وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على المصل المتوافق مع خط الخلية المعني. بمجرد إذابة الفيروس بالكامل ، قم بتخفيفه في DMEM في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 ملليلتر. ثم اضبط الحجم إلى مليلتر واحد مع متوسط مصل مخفض.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من البوليبرين إلى مليلتر واحد من الفيروس لكل وسيط واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. أضف ملليلترا واحدا من هذا الخليط إلى الخلايا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسيط المحتوي على الفيروس واستبدله ب DMEM العادي المكمل بنسبة 10٪ FBS وأعد الخلايا إلى الحاضنة.

راقب نمو الخلية وقم بتغيير الوسط كل يومين عندما تصل الخلايا إلى التقاء ، قم بتوسيع كل بئر من طبق الآبار المكون من ستة آبار إلى صفيحة زراعة أنسجة بطول 10 سم. انقل اللوحات إلى الحاضنة. أخيرا ، احفظ 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر و 50 ميكرولترا من DMEM على 384 لوحة فحص بئر.

ثم تحقق من مستوى التعبير عن البروتين الموسوم ب YFP تحت المجهر. إذا أظهر التعبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء تساوي أو تزيد عن ثلاثة ، فقم بإعداد مخزون الخلية لخط الخلية المقابل. لنقل المركب ، على لوح بولي بروبيلين تخزين 384 بئرا ، أضف التخفيفات التسلسلية للمركبات بواسطة سلسلة التخفيف القياسية من واحد إلى ثلاثة.

بعد ذلك ، باستخدام معالج سائل مزود برأس 384 شعريا ، قم بتوزيع 0.25 ميكرولتر من مثبطات البروتيازوم على ألواح فحص سوداء فارغة ومسطحة القاع 384 بئر. ثم البذور 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة على هذه اللوحات. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

قبل تصوير خط الخلية المعالج بمثبطات البروتيازوم ، أضف 10 ميكرولترات من DMEM الدافئ مسبقا بمحلول تلطيخ واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد التلوين ، ابدأ تشغيل برنامج تشغيل المجهر الآلي عن طريق تحديد علامة التبويب المجهر. أولا، حدد علامة تبويب التكوين ثم حدد الهدف 20 مرة في نوع اللوحة الصحيح.

للسماح بالتركيز بشكل صحيح مع أنواع مختلفة من اللوحات، تأكد من تعيين المتصل على القيمة الصحيحة على الهدف. بعد ذلك ، حدد التعريض الضوئي الأول. اضبط ارتفاع التركيز البؤري على صفر ميكرومتر، ثم حدد التركيز البؤري.

بمجرد التركيز ، قم بتعريض الكاميرا الأولى. لتحسين مستوى التعريض الضوئي ، اضبط ارتفاع التركيز وانقر فوق أخذ الارتفاع. قم بتغيير أوقات التعريض الضوئي وطاقة الليزر للحصول على أقصى كثافة بكسل تبلغ حوالي 3000 وحفظ معلمات التعريض الضوئي.

حدد علامة التبويب تعريف التجربة، وقم بإنشاء تخطيط وتخطيط فرعي. بعد ذلك ، قم بسحب وإسقاط تعريض التخطيط ذي الصلة والصورة المرجعية وملف الاقتصاص المنحرف والتخطيط الفرعي. ثم احفظ التجربة.

أخيرا ، حدد علامة تبويب التجربة التلقائية واحصل على الصور. بالنسبة للصور ثنائية القناة، حدد أولا خوارزمية البرنامج لتقسيم الكائنات الأساسية، مثل النوى والعصارة الخلوية والتجميعات. أولا ، قم بتوزيع 0.25 ميكرولتر من مثبط البروتيازوم المذاب في 100٪ DMSO أو DMSO على 384 بئرا من ألواح مسطحة القاع.

في نفس اللوحة ، قم بالبذور يدويا 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في 50 ميكرولتر من DMEM. ثم قم بإعداد وحدة التحكم البيئي لنظام المجهر إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتشغيل المجهر في وضع الإزهار واسع المجال وكإعدادات للبرنامج ، اختر LWD 20 مرة الوضع الموضوعي غير متحد البؤر ، وأربعة حقول لكل بئر ، وفاصل زمني للالتقاط لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، حدد الخوارزمية المناسبة لتقسيم الكائن الأساسي مثل العصارة الخلوية والمجاميع. اضبط عتبة الخلفية ومعلمات التباين إذا لزم الأمر. ظلت خطوط الخلايا المختبرة التي تم تحويلها بالنوع البري SOD-1 و SOD-1 A4V المتحولة بصحة جيدة ، وأظهرت مستويات عالية من التعبير ، ووضع العلامات على نطاق واسع على المدى الطويل بغض النظر عن شكل SOD.

عزز العلاج بمثبط البروتيازوم ALLN لمدة 24 ساعة تراكم مجاميع SOD-1 A4V YFP في خلايا HEK-293 ولكن ليس في الخلايا المنقولة SOD-1 Wild Type YFP. علاوة على ذلك ، كانت هناك مستويات منخفضة جدا من التجميع في خطوط الخلايا U2 OS و SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP المحولة بنفس النواقل. بعد زرع الخلايا في وجود أو عدم وجود ALLN ، تمت مراقبتها بحثا عن تكوين الكلي لمدة 50 ساعة.

وصل التكوين الكلي ل ALLN إلى هضبة في 24 ساعة وظل مستقرا خلال ال 12 ساعة التالية. علاوة على ذلك ، انخفضت كثافة الخلايا بشكل ملحوظ بعد 28 ساعة نتيجة للتأثير السام للخلايا ل ALLN ، بينما زاد عدد الخلايا في التحكم السلبي المعالج ب DMSO. تم تلطيخ خلايا SOD-1 A4V YFP المزروعة في وجود مثبطات البروتيازوم لمدة 24 ساعة بمحلول Hoechst.

تم قياس السمية النسبية لثلاثة مثبطات مختلفة للبروتيازوم عن طريق قياس عدد خطوط الخلايا الملتصقة المتبقية في البئر المسمى بصبغة Hoechst. انخفض العدد الإجمالي للخلايا استجابة لزيادة جرعة مثبطات الإنزيم البروتيني. على العكس من ذلك ، زادت النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن مجاميع SOD-1 A4V مع تركيز مثبط الإنياز

عند القيام بهذه العملية ، من المهم أن تتذكر أن جودة الخلية ستؤثر بشكل كبير على نتيجتك. لذلك من المهم تحديد أن الخلايا خالية من الميكروبلازما وصحية طوال الخطوات. بعد هذه العملية ، يمكن استخدام طريقة تصوير أخرى للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتدهور البروتين أو تفاعل البروتين مع الآخرين باستخدام نقل طاقة الرنين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء الأدوات لاختبار مصير البروتين في خلايا حية متعددة باستخدام تحليل الصور عالي المحتوى. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتجميع البروتين كما يحدث في النماذج الخلوية البسيطة. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة الخاصة بالمريض.