فحص الالتصاق في المختبر للكشف عن التصاق الخلايا السرطانية بمصائد العدلات خارج الخلية

في البيئة المكروية للسرطان ، تطلق العدلات المنشطة مصائد عدلات خارج الخلية ، أو NETs ، تتكون من ألياف الحمض النووي خارج الخلية ، والهستوين ، والبروتينات الحبيبية ، والتي تلعب دورا مهما في تطور السرطان.

لدراسة التصاق NET للخلايا السرطانية في المختبر ، أضف تعليق NET إلى آبار الألواح متعددة الآبار. احتضان لتشكيل NET أحادي الطبقة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة NETs غير الملتصقة.

أضف محلول بروتيني لمنع مواقع الربط الحرة في الآبار.

السرطانية المسماة بالفلورسنت على طبقات أحادية NET.

تتفاعل المستقبلات السطحية المحددة على الخلايا السرطانية مع NETs ، مما يسهل التصاق الخلايا.

بعد الحضانة ، تخلص من الوسائط من بئر التحكم السلبي.

أضف ديوكسيربونوكلياز لتحلل NETs ، وفصل الخلايا.

إزالة المحاليل من التحكم السلبي واختبار الآبار. استخدم المخزن المؤقت لإزالة الخلايا غير الملتصقة.

قم بإصلاح الخلايا السرطانية الملتصقة ب NETs باستخدام الفورمالديهايد.

باستخدام المجهر الفلوري ، تصور الخلايا السرطانية الفلورية الملتصقة ب NETs.

تظهر آبار الاختبار التصاق الخلايا السرطانية بشكل كبير ب NETs ، بينما تظهر NETs المعالجة بمنقوص الأكسجين ريبونوكلياز مستويات منخفضة من التصاق الخلايا السرطانية.

أضف 100 ميكرولتر من مخزون NET في كل بئر من صفيحة قاع مسطحة مكونة من 96 بئرا ، واحتضن اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الظلام لتغطية الآبار. بعد 12 إلى 20 ساعة ، استخدم مجهرا للتحقق من تكوين طبقة أحادية موحدة من الشبكات الخالية من الخلايا في قاع الآبار. بمجرد التحقق من الطبقة الأحادية ، قم بشفط جميع المواد غير الملتصقة برفق من الآبار ، مع التأكد من عدم تعطيل الطبقة الأحادية في الأسفل.

هذا هو الجانب الأكثر تحديا في هذا الإجراء. من أجل الحفاظ على طبقة أحادية NET مناسبة ، عليك التعامل مع اللوحة بعناية فائقة. أضف جميع الكواشف والخلايا ببطء على جانب الآبار. استنشق برفق شديد ، وتجنب لمس قاع البئر بطرف الشفط.

مع إزالة المادة غير الملتصقة ، أضف برفق 100 ميكرولتر من محلول حجب الألبومين البقري بنسبة 1٪ إلى كل بئر ، واتركه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. لا تقم بتقليب اللوحة أو هزها لأن ذلك قد يعطل طبقة NET أحادية.

بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا السرطانية A549 عن طريق حصادها عندما تكون متقاربة بنسبة 70 إلى 80٪ باستخدام التقنيات القياسية. أعد تعليق الخلايا في وسط بتركيز 2 × 10⁴ خلايا لكل 100 ميكرولتر. قم بتلطيخ الخلايا بإضافة ميكرولتر واحد من CFSE لكل مليلتر من الوسط ، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في الحجم الأولي للوسط للحفاظ على تركيز 2 × 10⁴ خلايا سرطانية لكل 100 ميكرولتر من الوسط.

خذ اللوحة المطلية ب NET ، واستنشق محلول الحظر برفق. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية السرطانية إلى كل بئر ، واترك الخلايا تلتصق بالصفيحة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

استنشق السائل بالكامل ، وأضف 1,000 وحدة من DNase I إلى بعض الآبار لمدة 10 دقائق لتحلل NETs. في الآبار الأخرى ، أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم لكل بئر لمدة 10 دقائق كتحكم في السيارة. بعد ذلك ، قم بشفط السائل برفق من كل بئر ، واغسله ب 100 ميكرولتر من PBS لإزالة أي خلايا A549 غير ملتصقة.

قم بالشفط والتخلص من جميع المحاليل في الآبار ، مع ترك NETs والخلايا السرطانية الملتصقة فقط في الأسفل. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ لكل بئر لإصلاح الخلايا. انقل اللوحة على الفور إلى مجهر فلوري لقراءة الفحص ، ثم قم برسم النتائج وتحليلها باستخدام برنامج تحليل البيانات.