الكشف عن بروتينات البريون غير الطبيعية في أنسجة المخ باستخدام الكيمياء المناعية

خذ شريحة بها قسم ثابت لدماغ الثدييات يظهر مجاميع بروتين البريون غير المطوية.

عالج القسم بحمض الفورميك لتقليل عدوى مجاميع البريون.

عالج بمخزن مؤقت حمضي داخل غرفة الضغط الرطبة. تكسر الحرارة العالية ودرجة الحموضة الحمضية روابط البروتين المتشابكة الناجمة عن التثبيت ، مما يكشف عن حواتم المستضد.

اغمر في بيروكسيد الهيدروجين لتعطيل البيروكسيديز الداخلي ، مما يمنع تلطيخ الخلفية غير المرغوب فيه.

ضع الشريحة في لوحة غطاء وأضف عازلة للحفاظ على ترطيب الأنسجة.

أدخل محلول مانع يمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

أضف جسما مضادا أوليا خاصا بمجاميع البريون.

قم بإزالة جزيئات الأجسام المضادة غير المرتبطة. إدخال جسم مضاد ثانوي بيوتينيل يرتبط بالجسم المضاد الأساسي.

قم بإزالة جزيئات الأجسام المضادة غير المرتبطة. أضف إنزيم بيروكسيداز البيوتينيل المركب مع أفيدين الذي يرتبط بالبيوتين على الجسم المضاد الثانوي.

أضف ركيزة كروموجينيك، يتأكسد منها البيروكسيديز في منتج ملون.

باستخدام المجهر ، راقب الركام الملطخ.

اغمر أقسام الأنسجة بعناية في حمض الفورميك بنسبة 98٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اشطف الأقسام بماء الصنبور لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالشطف مرتين بالماء المقطر. استخدم حاوية تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ في غرفة الضغط مملوءة ب 500 مل من الماء المقطر للمعالجة المسبقة للعازلة 10 مللي مولار للسترات عند 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

لأغراض مراقبة الجودة ، ضع قسما من شريط مؤشر الأوتوكلاف اللاصق على السلة لمراقبة درجة الحرارة والضغط. بمجرد أن يشير الإنذار إلى أن الجهاز قد وصل إلى وقت البرنامج ودرجة الحرارة ، اغمر السلة بالشرائح. بعد ذلك ، ابدأ البرنامج على غرفة الضغط لضبط النقطة الثانية ، وسجل الضغط الأولي والنهائي لهذا البرنامج.

لتعطيل البيروكسيديز الذاتي ، اغمر سلة الشرائح التي تحتوي على أقسام العينة في حمام من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ في الميثانول لمدة 30 دقيقة. شطف الأقسام تحت الماء الجاري لمدة 5 دقائق. بعد التصريف ، اغمر الأقسام في محلول ملحي مخزن لمدة 5 دقائق إضافية. للكشف عن المناعة ، ضع كل شريحة على حامل لوحة غطاء متوفر تجاريا مبلل مسبقا بمحلول ملحي مخزن ثلاثي.

مع مواجهة جانب الأنسجة للحامل ، وحواف منزلقة تتزامن مع النقطتين السفليتين للحامل ، تأكد من تجنب فقاعات الهواء. أمسك مجموعة حامل الشريحة بين الإبهام والسبابة. احتفظ بإصبع واحد أعلى شريحة العينة والآخر في الجزء السفلي من الحامل. ثم ضع التجميع في معرض النظام.

للتأكد من أن المجموعة مجمعة جيدا ، املأ البئر بين شريحة العينة والحامل بمحلول ملحي مخفض ثلاثي ، دون أن يفيض. من هذه النقطة ، تأكد من الاحتفاظ بحوالي 80 ميكرولترا من محلول ملحي مخزن في Tris بين الحامل والشريحة. لا تدع الأقسام تجف.

تقليل تلطيخ الخلفية قبل العلاج بالجسم المضاد الأساسي عن طريق احتضان عينات الشرائح مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام مصل طبيعي بنسبة 20٪ من نفس النوع مثل مضيف الجسم المضاد الثانوي في محلول ملحي مخزن في Tris. بدون غسل الأقسام ، ضع 200 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي مباشرة في كل بئر من مجموعة حامل الشرائح ، واحتضنه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لغسل الأقسام ، املأ الآبار بمحلول ملحي مخزن ، وانتظر لمدة 5 دقائق. كرر الغسيل مرتين. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل بتركيز 1 إلى 200 في محلول ملحي مخزن ثلاثي مع مصل حصان بنسبة 10٪.

قم بإصلاح الحجم المطلوب ، اعتمادا على عدد الأقسام المراد معالجتها. ضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية على كل بئر من مجموعة حامل الشرائح. بعد 30 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، كرر الغسيل الملحي المخزن في Tris.

للحضانة مع مركب أفيدين بيوتين بيروكسيديز ، قم بإعداد الكاشف قبل 30 دقيقة من الاستخدام. وتطبيق 200 ميكرولتر من المحلول في كل بئر من حامل اللوحة المنزلقة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم باحتضان حامل اللوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.