عزل الخلايا العصبية الحسية والزراعة المشتركة مع الخلايا القاتلة الطبيعية

خذ عقدة الجذر الظهري أو DRG ، وهي مجموعة من الخلايا العصبية الحسية ، في وسط بارد يحتوي على مصل لحماية الخلايا العصبية أثناء المعالجة اللاحقة.

جهاز الطرد المركزي ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.

أضف عازلة فوسفات تحتوي على إنزيمات هضمية واحتضانها بتحريض خفيف.

تفصل الإنزيمات المصفوفة خارج الخلية ، أو ECM ، وأنسجة DRG ، مما يؤدي إلى إرخاء الخلايا.

أضف وسيطا يحتوي على مصل لتعطيل الإنزيمات.

جهاز طرد مركزي ، ثم تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق DRG وفصل الأنسجة ميكانيكيا باستخدام ماصات ذات أحجام أصغر تدريجيا للحصول على تعليق خلوي.

ضع طبقة من الخلايا على تدرج كثافة من ألبومين مصل الأبقار.

الطرد المركزي. تستقر الخلايا العصبية في القاع ، وتشكل حبيبات.

تخلص من الطبقات التي تحتوي على بقايا الأنسجة.

أعد تعليق الخلايا العصبية في وسط الثقافة.

أضف الخلايا العصبية إلى طبق ثقافة مغطى ب ECM واحتضنها.

قم بإزالة الوسط وأضف الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية.

أضف وسيطا للزراعة المشتركة ودراسة التفاعل بين هذه الخلايا.

احصد DRGs في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مملوء ب 10 مل من DMEM المثلج البارد. ثم ، قم بالطرد المركزي للمستحضر لمدة 5 دقائق عند 200 جم في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 250 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجيناز الرابع و 2.4 وحدة لكل مليلتر Dispase أيضا. احتضن DRG بمحلول الكولاجيناز المتباين لمدة 80 دقيقة مع تحريك خفيف.

لتعطيل الإنزيمات ، أضف 5 ملليلتر من وسط DMEM المكمل وقم بالطرد المركزي للمحلول عند 200 جم. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة واترك حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية لتجنب فقدان الخلايا غير المرغوب فيه. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من DMEM المكملة إلى الخلايا واستخدم مسدس ماصة وثلاث ماصات زجاجية من Pasteur ذات الأحجام المتناقصة لتحويل DRG برفق إلى مستحضر أحادي الخلية.

باستخدام ماصة P200 ، أضف معلق العقد الثلاثي الذي يحتوي على الخلايا العصبية على جانب الأنبوب في تدرج BSA. بعد ذلك ، اضبط التسارع والتباطؤ على الحد الأدنى لطرد الخلايا العصبية التي تحتوي على تدرج BSA لمدة 12 دقيقة عند 200 جم. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من القاعدية العصبية.

لوحة 10,000 خلية عصبية لكل بئر في صفيحة مسطحة القاع 96 بئر مطلية باللون اللامينين. للسماح بربط الخلايا العصبية ، احتضن الصفيحة المكونة من 96 بئرا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لبدء الزراعة المشتركة ، قم بإزالة القاعدة العصبية ببطء من ثقافة الخلايا العصبية وأضف 10⁵ خلايا NK لكل بئر إلى ثقافة الخلايا العصبية.