تقييم الوصلة العصبية العضلية الوظيفية عن طريق التحفيز البصري المتزامن وتسجيل الفيديو

ابدأ بمفاعل حيوي مع غرفة عضلية تحتوي على أنسجة عضلية مدمجة في الكولاجين مدعومة فوق أعمدة الغرفة.

قناة الغلاف العصبي على غلاف عصبي في مصفوفة الكولاجين. تعبر الخلايا العصبية الحركية للغلاف العصبي عن القنوات الحساسة للضوء.

أضف وسيطا تمايزا يحتوي على عوامل النمو العصبي التي تحفز الخلايا العصبية على توسيع توقعاتها.

تبادل الوسط بانتظام لضمان امتداد الخلايا العصبية المستمر نحو الأنسجة العضلية ، وتشكيل الوصلات العصبية العضلية.

راقب المفاعل الحيوي تحت مجهر مزود بكاميرا ومصدر ضوء أزرق.

قم بتطبيق نبضات الضوء الأزرق لفتح القنوات الحساسة للضوء في الخلايا العصبية ، مما يسمح للأيونات من الوسط بالتدفق وتحفيز الخلايا العصبية على توليد إشارات كهربائية.

تنتقل هذه الإشارات عبر الإسقاطات العصبية إلى الوصلات العصبية العضلية ، وتنقل الإشارة الكهربائية إلى الأنسجة العضلية.

سجل مقطع فيديو في وقت واحد. يؤكد الانكماش التدريجي للألياف العضلية تطور تقاطع عصبي عضلي وظيفي.

تحضير مزيج من 4 إلى 1 من 3 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجين الأول ومصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان. ثم أعد تعليق الأرومات العضلية في خليط الكولاجين الطازج هذا.

بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من معلق الكولاجين الخلوي هذا إلى كل غرفة عضلية في المفاعل الحيوي ، مع التأكد من نشر المعلق عبر كلا العمودين باستخدام طرف الماصة. اترك خليط هلام الخلية يتبلمر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، املأ كل مفاعل حيوي جيدا ب 450 ميكرولتر من وسائط النمو العضلي.

في اليوم الحادي عشر من تمايز الخلايا العصبية الحركية ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، واترك المجالات العصبية تستقر في القاع لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 15 مل من وسط ثقافة تعليق الخلايا العصبية الحركية مع 20 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ و 10 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية.

في اليوم 14 من بروتوكولات التمايز ، قم بزرع الخلايا العصبية الحركية في المنصة. تحضير خليط هلام من 4 إلى 1 من 2 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجين الأول ومصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان. استخدم مصفاة خلوية 400 نانومتر لاختيار المجالات العصبية الكبيرة ، وإعادة تعليقها في خليط الهلام المحضر.

بعناية ، استنشق الوسائط من الخزان والغلاف العصبي جيدا. ثم أضف 15 ميكرولترا من خليط الجل إلى قناة الغلاف العصبي. قم بتحميل ماصة سعة 10 ميكرولتر ب 10 ميكرولتر من الجل ، واختر كرة عصبية واحدة. قم بإيداع الغلاف العصبي في قناة الغلاف العصبي ، مع التأكد من وجوده في الغرفة. بعد ذلك ، ارفع الماصة ببطء مع تحرير الجل المتبقي بمجرد ترسيب الغلاف العصبي.

اترك الجل يتبلمر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 450 ميكرولتر من NbActiv4 مكملا ب 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ و 10 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية إلى الخزانات.

للتصوير ، استخدم مجهر فلورسنت مقلوب مع برنامج كاميرا علمي تكميلي لأشباه الموصلات بأكسيد المعدن. اضبط التجميع على 2 × 2 ، والتعريض الضوئي إلى 20 مللي ثانية ، وتشغيل الغالق الدوار ، ومعدل القراءة على 540 ميجاهرتز ، والنطاق الديناميكي إلى 12 بت والكسب 1 ، ووضع المستشعر للتداخل. استخدم هدفا 2x على المجهر لتصوير الأنسجة الدقيقة ، وقم بإرفاق غرفة الخلايا الحية بمرحلة المجهر.

حدد منطقة الاهتمام التي تحتوي على الأنسجة الهيكلية المعصبة لتقليل حجم الملف ووقت المعالجة. بعد ذلك ، ضع مرشح انبعاث بطول 594 نانومتر بين العينة وهدف التصوير لتصفية نبضات الضوء الأزرق من الكاميرا. بعد ذلك ، ضع صفيحة مستطيلة الشكل من أربعة آبار تحتوي على أربعة مفاعلات حيوية في غرفة الخلية الحية. ثم انقر فوق Live View، وقم بالتوسيط، وركز الصورة بعائد الاستثمار المطلوب.

قم بتنزيل رمز الماكرو المخصص من مجلد GitHub للتحكم في موضع المسرح ولوحة Arduino والحصول على الفيديو. ثم اضبط الفيلم الناتج على day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. قم بتشغيل الماكرو باستخدام إحداثيات x و y المطلوبة الموضوعة على المسرح ، واحصل على فاصل زمني سريع مع 1,700 إطار بمعدل 50 إطارا في الثانية.

بعد التصوير ، استبدل الوسائط وأعد العينات إلى الحاضنة. اترك 24 ساعة على الأقل بين جلسات الحصول على الصورة لتجنب إجهاد الأنسجة.