تصوير وقياس مجاميع البروتين في أدمغة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا

ابدأ بأدمغة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا. تعبر هذه الأدمغة عن بروتين متحور أحمر يحمل علامة فلورية في الخلايا العصبية يمكن أن ينتشر إلى الخلية الدبقية المحيطة ، مما يعبر عن البروتين الطبيعي الأصفر الموسوم بالفلورسنت ، مما يتسبب في تجميعها.

أضف حلا مثبتا يحافظ على سلامة الخلوية.

قم بإزالة المثبت واغسله بمخزن مؤقت.

أضف كاشفا مضادا للبهتان واحتضنه لمنع تلاشي إشارات الفلورسنت.

انقل الأدمغة إلى شريحة وقم بإزالة السوائل الزائدة.

اسمح للأدمغة بالالتصاق بالشريحة.

باستخدام قطع صغيرة من الغطاء كفواصل ، ضع غطاء فوقها. أضف الكاشف المضاد للبهتان وأغلقه.

تحت المجهر متحد البؤر ، التقط صورا باستخدام أطوال موجية مختلفة للإثارة للتألق الأحمر والأصفر.

باستخدام برنامج تحليل الصور ، حدد مجاميع البروتين.

التوطين المشترك للتألق الأحمر والأصفر إلى انتشار البروتينات الطافرة.

جميع الأدمغة ، انقل أنبوب التجميع إلى مغذي في درجة حرارة الغرفة وهزها لمدة 5 دقائق تقريبا. بعد فترة التثبيت ، قم بإزالة غالبية محلول التثبيت باستخدام ماصة P1000 وتخلص منها ، مع الحرص الشديد على ترك الأدمغة في الأنابيب. هذا يتطلب شفطا لطيفا ومراقبة دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من PBST الطازج إلى الأدمغة. قم بتغطية الأنبوب واتركه يتأرجح على المغذي لمدة دقيقة تقريبا لغسل المثبت المتبقي. ثم قم بإزالة المحلول وكرر خطوة الغسيل القصيرة هذه.

اتبع الغسلتين القصيرتين بغسلة واحدة لمدة 5 دقائق ، ثم ثلاث غسلات لمدة 20 دقيقة ، وأخيرا غسلة واحدة لمدة ساعة. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة معظم PBST بعناية واغمر الأدمغة في 30 ميكرولترا من الكاشف المضاد للبهتان القائم على الجلسرين. بعد ذلك ، احتضان الدماغ عند 4 درجات مئوية في الظلام دون حركة لمدة 1 إلى 24 ساعة.

في وقت لاحق ، قم بإزالة الأدمغة من أنبوب التجميع باستخدام طرف ماصة ضعيف وانقلها إلى شريحة مجهرية. بعد ذلك ، قم بتوجيه الأدمغة برفق حسب الحاجة للتصوير باستخدام الملقط. يمكن تركيب عينات متعددة على نفس الشريحة في صفوف منفصلة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الكاشف الزائد المضاد للبهتان من الشريحة باستخدام زاوية نسيج المختبر المطوي. لا تدع الأنسجة تتلامس مع الدماغ. بعد ذلك ، اترك العينات في الظلام لمدة 5 إلى 10 دقائق للسماح للأدمغة بالالتصاق بالشريحة.

بعد ذلك ، خذ قطعا صغيرة من زجاج الغطاء المكسور وضعها حول الدماغ ، وتغطي مساحة تبلغ مساحتها حوالي 19 ملم مربع. بعد ذلك ، قم بخفض زجاج غطاء 22 ملم مربع برفق فوق فسيفساء الأدمغة والزجاج لعمل جسر مثبت. بعد ذلك ، قم بتوزيع الكاشف الطازج المضاد للبهتان ببطء تحت الغطاء حتى يملأ المساحات الفارغة. افعل ذلك بحذر شديد حتى تظل الأدمغة والزجاج في مكانهما. ثم ، ختم الغطاء مع طلاء الأظافر. أولا ، فقط قم بتطبيقه في الزوايا. دع الزاوية تجف من 5 إلى 10 دقائق قبل إكمال الختم على طول الحواف. يجب تصوير الأدمغة في أسرع وقت ممكن.

قم بتصوير الأدمغة المركبة باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بهدف زيت 40x أو 63x لجمع شرائح z في منطقة الدماغ حيث يتم التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا. بعد ذلك ، قم بتحليل البيانات عن طريق تحديد النقاط في شرائح z الفردية أو ، بدلا من ذلك ، بعد عرض الشرائح في ثلاثة أبعاد.

لتحديد مجاميع هنتنغتون الطافرة المنفصلة جيدا ولها إشارة خلفية قليلة ، افتح سلسلة z متحدة البؤر في وضع العرض ثلاثي الأبعاد . بعد ذلك، استخدم معالج التحليل لتحديد المواقع الفردية في قناة محددة.

في الإعدادات، اضبط العتبة والمرشحات لتمثيل جميع التجميعات ذات الحجم غير المتجانس بدقة ككائنات فردية في الصورة. بعد ذلك، قم بتمكين تقسيم الكائنات ضمن التصفية المسبقة للمعالجة الثنائية لفصل التجميعات المرتبطة ارتباطا وثيقا. يتم الإبلاغ عن المعلومات الكمية حول الكائنات التي يحددها البرنامج ضمن القياسات.

بعد حساب النقاط ، قم بتمييزها بشكل أكبر في برنامج تحليل الصور. على سبيل المثال ، قم بإجراء القياسات ذات الصلة للبقع أو الأسطح للحصول على معلومات القطر الكلي أو الحجم أو الشدة. يمكن قياس بعض مجاميع هنتنغتون من النوع البري عن طريق التحرك يدويا عبر المكدس z وعد النقاط الخضراء التي يمكن تمييزها عن الإشارة المنتشرة المحيطة.

احرص على تجنب عد المجاميع الفردية مرتين عند ظهورها في أكثر من شريحة واحدة. تحليل آخر مثير للاهتمام هو تحديد تواتر التوطين المشترك بين مجاميع هنتنغتون Q25-YFP و هنتنغتون Q91-mChery. قم بذلك باستخدام العد اليدوي عن طريق تحريك شريحة تلو الأخرى من خلال مكدس z متحد البؤر.