تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام العديد من الأساليب الفيروسية والكيميائية الحيوية لتشريح دور مسار إشارات المضيف في النسخ المتماثل لفيروس الهربس النموذجي. هنا على سبيل المثال ، ندرس دور بروتين إشارات الميتوكوندريا المضاد للفيروسات Mavs أثناء الإصابة بفيروس الهربس جاما HV 68. أول من فحص دور Mavs أثناء العدوى الحادة ، تصاب الفئران من النوع البري و Mavs بالضربة القاضية ب gamma HV 68 بعد عدوى فيروسية حادة.

يتم جمع رئة الفأر ويتم تحديد الأحمال الفيروسية عن طريق مقايسة البلاك التي يتم فيها تخفيف العينات وتصفيتها بشكل مسلسل. ثم يتم حساب عدد اللويحات في الطبقات الأحادية تشير الأحمال الفيروسية المتزايدة في الفئران بالضربة القاضية إلى أن الجين المعني يلعب دورا مضادا للفيروسات.

على النقيض من ذلك ، تشير الأحمال الفيروسية المنخفضة في الفئران بالضربة القاضية إلى أن الجين مطلوب للعدوى الفيروسية للتحقق من صحة هذه النتائج. يتم فحص حركية النمو الفيروسية متعددة الخطوات في المختبر في الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، والنوع البري ، والخلايا الليفية الجنينية للفأر بالضربة القاضية مصابة ب gamma HV 68 ويتم تحضنها لأوقات مختلفة. ثم يتم جمع الخلايا ويتم إجراء فحوصات البلاك لمقارنة حركية النمو متعددة الخطوات بين الخلايا البرية والخلايا التي تعاني من نقص في mavs.

لمزيد من التحقق من صحة هذه النتائج ، تصاب الخلايا الليفية الجنينية للفأر من النوع البري و mavs بالضربة القاضية بجاما HV 68. ثم يتم استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي بشكل منفصل من الخلايا المصابة ويتم تحليل النصوص الجينومية الفيروسية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. خطرت لنا فكرة هذا البروتوكول لأول مرة عندما درسنا دور مسار مناعة المضيف أثناء عدوى حيرات الفيروس.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في قواعد مسارات إشارات المضيف أثناء الإصابة بمسببات الأمراض الأخرى. ابدأ هذا الإجراء بالسماح للفئران المصنوعة من القمامة المطابقة بين الجنسين التي تتراوح أعمارها بين ستة إلى ثمانية أسابيع بالتأقلم لمدة أربعة أيام بعد الشحن. وستجرى التجربة التالية في مرفق للمخاطر البيولوجية.

استعدادا ، ارتد معدات الحماية الشخصية بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والقناع والجوارب التي تعمل في خزانة السلامة البيولوجية. المستوى الثاني. تحضير المعلق الفيروسي مع 40 إلى 10,000 PFU من جاما HV 68 و 30 ميكرولتر من PBS المعقم لكل فأر سيصاب

حافظ على المعلق الفيروسي على الجليد بعد الحقن داخل الصفاق من الكيتامين زيلازين. تأكد من تخدير الفئران عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. ثم باستخدام ماصة ، قم بتوصيل 30 ميكرولترا من المعلق الفيروسي بالتنقيط إلى فتحة الأنف اليسرى أو اليمنى.

ضع الفأر على جانبه لمدة خمس إلى 10 دقائق لتسهيل توصيل مجرى الهواء للفيروس إلى الرئة. ثم ضع الفئران مرة أخرى في قفصها وراقبها حتى تتعافى تماما من التخدير. بعد ذلك ، يتم جمع أنسجة الرئة من الفئران المحقونة لإعداد محللة الخلية لتقييم عيار الفيروس في أيام مختلفة بعد الإصابة.

ضع الرئتين المحصودة من الفئران المضحية في أنابيب غطاء لولبي معقمة سعة 1.5 مليلتر تحتوي على 500 ميكرولتر من حبات سيليكا الزركونيا 1.0 ملم على الجليد. إذا لم يكن المتابعة إلى الخطوة التالية في نفس اليوم. قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

خلاف ذلك ، أضف ملليلتر واحد من DMEM الخالي من المصل البارد. ضع الأنبوب في مضرب حبة واضغط على ابدأ لتجانس الرئتين لمدة 30 ثانية. لتجنب ارتفاع درجة حرارة العينة التي قد تؤدي إلى تعطيل الفيروس.

قم بتبريد الأنبوب على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل بعد 30 ثانية من التجانس. ثم كرر هذه العملية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنسجة المتجانسة عند 16 ، 000 RCF عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.

بعد الدوران ، سيكون حطام الخلية في قاع الأنبوب وستكون الدهون على السطح. خذ على الفور snat كما هو موضح هنا لإجراء فحص البلاك باستخدام المعاهد الوطنية للصحة ثلاثة T ثلاثة أو BHK 21 أحادي الطبقة. بعد ذلك ، يتم إجراء فحص البلاك لتحديد العيار الفيروسي الموجود في العينة ، ابدأ مقايسة البلاك عن طريق التخفيف التسلسلي للطافي الفيروسي.

أولا باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 270 ميكرولترا من الوسائط إلى لوح 96 بئر. اترك الصف الأول فارغا. ثم أضف 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى الصف الأول من لوحة الألواح المكونة من 96 بئر ، كل عينة في ثلاث نسخ.

بعد ذلك ، انقل 30 ميكرولترا من العينة من الصف الأول إلى الصف التالي واخلطها. ثم انقل 30 ميكرولترا من الخليط إلى الصف التالي واخلطه. كرر هذه الخطوة عدة مرات لعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف.

بعد ذلك ، أضف المادة الطافية الفيروسية المخففة إلى طبقة أحادية الخلية. في طبق 24 بئر. ضع اللوحة في حاضنة وقم بهز الطبق كل 30 دقيقة خلال حضانة لمدة ساعتين بعد الحضانة لإزالة بقايا الخلية ، وشفط المادة الطافية من اللوحة.

ثم اغسل الخلايا مرة واحدة بوسط جديد. بعد الغسيل ، أضف وسطا يحتوي على ميثيل السليلوز إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة أربعة إلى ستة أيام.

بعد مرور أربعة إلى ستة أيام. استخدم مجهرا لقراءة رقم البلاك لكل عينة. سجل عدد اللويحات لكل تخفيف.

ثم احسب المتوسط والانحراف المعياري. لا يمكن استخدام الآبار التي تحتوي على عدد كبير جدا أو عدد قليل جدا من اللويحات لحساب العيار بدقة. لذلك لكل عينة ، استخدم مخففا يحتوي على سبعة إلى 70 لويحة.

هذه العينة المخففة 1000 ضعفا لها متوسط 23 لوحة لكل بئر. لحساب العيار الفيروسي في المحلول غير المخفف ، اضرب عامل التخفيف في عدد اللويحات في عدد الميكرولتر في المليلتر. ثم اقسم ذلك على حجم المادة الطافية المخففة المضافة لكل بئر.

إذن، في هذا المثال، 1000 في 23 لويحة مضروبة في 1000 ميكرولتر لكل مليلتر مقسومة على 100 ميكرولتر تساوي 2.3 في 10 أس وحدة التشكيل الخامسة لكل مليلتر. بعد ذلك ، يتم استخدام محلول مخزون فيروسي ذو عيار معروف لتحديد حركية نمو جاما HV 68 في الخلايا الليفية الجنينية للفأر ORMs تبدأ بتقسيم الأساطير البرية وتلك التي تعاني من نقص في الجين المضيف إلى صفيحة 24 بئرا عند 10،000 خلية لكل بئر. في اليوم التالي ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر ب 0.5 مل من تعليق جاما HV 68 منخفض MOI.

ضع اللوحة في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية واترك الحضانة تستمر لمدة ساعتين طوال فترة الحضانة. هز الطبق كل 30 دقيقة بعد الحضانة. استخدم ماصة لإزالة المعلق الفيروسي وأضف 0.5 مل من DM EM الكامل الطازج الذي يحتوي على 8٪ مصل بقري جنيني إلى الخلايا المصابة بالفيروس.

ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة في أيام مختلفة بعد الإصابة. احصد الخلايا الطرفية المتوسطة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقلها إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مليلتر ، وقم بتجميد الأنابيب على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لإطلاق جاما HV 68 من Mets.

قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد والذوبان. قم بإذابة الخلايا عن طريق وضعها عند 37 درجة مئوية. ثم دوامة وضعها مرة أخرى في الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

حدد العيار الفيروسي عن طريق فحص البلاك باستخدام الطبقة الأحادية للمعاهد الوطنية للصحة أو ثلاثة أو ثلاثة أو BHK 21 كما هو موضح سابقا لفحص ما إذا كان تكرار الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي يتأثر بنقص الجينات المضيفة أو الجينات الفيروسية. ابدأ بالمصابات المصابة في أيام مختلفة بعد الإصابة ، وتخلص من المادة الطافية ، واشطف الخلايا بالخلايا الباردة PBS وخلايا الجليد التربسين. ثم قم بتكسير الخلايا عن طريق التمركز عند 1000 RCF في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة بعد الدوران ، وتخلص من المادة الطافية وقم بتخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

استخراج الحمض النووي الكلي والحمض النووي الريبي ، وهو من أصل مضيف وفيروسي. ثم الطرد المركزي أعمدة الدوران. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام الحمض النووي الكلي والتمهيدي الخاص بالنصوص اللايتية الفيروسية.

تحديد الكمية النسبية لجينوم جاما HV 68 داخل الخلايا في إشارة إلى جين التدبير المنزلي المضيف مثل بيتا أكتين. قم بإعداد CDNA باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي وأوليجو DT التمهيدي. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام CD NA والبادئات على النحو الوارد أعلاه لتحديد الكمية النسبية للنصوص الفيروسية.

في إشارة إلى جين التدبير المنزلي المضيف ، فإن Mavs هو اختصار للإشارات المضادة للفيروسات في الميتوكوندريا كما هو موضح هنا. ينقل جزيء محول Mavs الإشارات من عين العصارة الخلوية مثل المستقبلات لتنشيط NF kappa B والعوامل التنظيمية للإنترفيرون IRFs التي بدورها تنظم التعبير الجيني للسيتوكينات والإنترفيرون المؤيدة للالتهابات. تظهر هنا الأحمال الفيروسية في رئة الفئران البرية المصابة ب جاما HV والفئران التي تعاني من نقص في Mavs.

النقص في Mavs إلى تقليل الأحمال الفيروسية في الرئة بشكل كبير بعد 10 أيام من الإصابة ، مما يشير إلى أن Mavs مطلوب للعدوى الفيروسية الفعالة في الجسم الحي. يوضح هذا الشكل منحنى نمو فيروسي متعدد الخطوات على الخلايا الليفية الجنينية للفأر من النوع البري ، وتلك التي تعاني من نقص في Mavs في Mavs. تأخر النمو الفيروسي بشكل كبير على الخلايا الليفية الجنينية للفأر مما يشير إلى أن Mavs مطلوب للتكاثر الفيروسي الفعال في المختبر mRNA ، تم تحليل مستويات الجينات الليبية الفيروسية في الخلايا الليفية الجنينية المصابة بالفأر HV 68 عن طريق نقص تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في Mavs ، مما قلل بشكل كبير من مستويات mRNA لثلاثة جينات محللة أساسية.

تدعم كل هذه النتائج بشكل جماعي الاستنتاج القائل بأن Mavs مطلوب لتنشيط نسخ جاما HV 68 ، والنسخ المتماثل اللايتي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استجواب تفاعل العامل الممرض المضيف على مستويات متعددة ، سواء في VO أو Vevo. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض قد يكون مترددا للغاية.

يجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء السير في العروض.