تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام مناهج فيروسية وبيوكيميائية متنوعة لتحليل دور مسار تأشير في العائل في التكاثر التحليلي لفيروس هرپس نموذجي. وهنا، كنموذج، نبحث في دور بروتين تأشير الفيروسات الميتوكوندريا Mavs أثناء العدوى بفيروس هرپس gamma HV 68. أولاً، لبحث دور Mavs أثناء العدوى الحادة، يتم إيصال عدوى gamma HV 68 إلى فئران من النوع البري وفئران مفقدة لجين Mavs في أعقاب عدوى فيروسية حادة.

يتم جمع رئة الفأر وتحديد الأحمال الفيروسية بواسطة مقايسة اللويحات (plaque assay) حيث يتم تخفيف العينات تسلسلياً وزراعتها في أطباق. ثم يتم عد عدد اللويحات على الطبقات أحادية الخلية. ويشير ارتفاع الأحمال الفيروسية في الفئران التي تم تعطيل الجين فيها (knockout mice) إلى أن الجين المستهدف يلعب دوراً مضاداً للفيروسات.

وفي المقابل، تشير الأحمال الفيروسية المنخفضة في الفئران التي تعاني من تعطيل الجينات إلى أن الجين ضروري للعدوى الفيروسية. وللتحقق من هذه النتائج، يتم فحص حركية نمو الفيروس متعدد الخطوات في المختبر في الخلايا الليفية الجنينية للفئران؛ حيث يتم إصابة الخلايا الليفية الجنينية للفئران من النوع البري وتلك التي تعاني من تعطيل جين mavs بفيروس gamma HV 68 وحضنها لفترات زمنية مختلفة. ثم تُجمع الخلايا وتُجرى مقايسات اللويحات لمقارنة حركية النمو متعدد الخطوات بين خلايا النوع البري والخلايا التي تفتقر إلى mavs.

لمزيد من التحقق من هذه النتائج، يتم إصابة خلايا الأرومات الليفية الجنينية للفئران من النوع البري وتلك التي تعاني من حذف جين mavs بفيروس gamma HV 68. بعد ذلك، يتم استخلاص DNA و RNA بشكل منفصل من الخلايا المصابة، وتحليل النسخ الجينية الفيروسية باستخدام تقنية real-time PCR. لقد خطرت لنا فكرة هذا البروتوكول لأول مرة عندما درسنا دور مسار المناعة المضيفة أثناء العدوى الفيروسية الحالة.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول المحتمل لبحث قواعد مسارات إشارات المضيف أثناء العدوى بمسببات أمراض أخرى. ابدأ هذا الإجراء بالسماح للفئران من نفس العمر (من ستة إلى ثمانية أسابيع) ومن نفس الجنس ومن نفس البطن بالتأقلم لمدة أربعة أيام بعد الشحن. ستُجرى التجربة التالية في مرفق للمخاطر البيولوجية.

كجزء من التحضير، ارتدِ معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك معطف المختبر، والقفازات، والقناع، وأغطية الأحذية، مع العمل داخل خزانة السلامة البيولوجية من المستوى الثاني. قم بتحضير المعلق الفيروسي بحيث يحتوي على 40 إلى 10,000 PFU من gamma HV 68 و 30 µL من محلول PBS المعقم لكل فأر سيتم إصابته.

يُحفظ المعلق الفيروسي على الثلج بعد إجراء حقن داخل الصفاق من الكيتامين والزيلازين. تأكد من تخدير الفئران عن طريق القيام بقرص إصبع القدم. بعد ذلك، وباستخدام ماصة، يتم وضع 30 µL من المعلق الفيروسي قطرة تلو الأخرى في إما فتحة الأنف اليسرى أو اليمنى.

ضع الفأر على جانبه لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق لتسهيل وصول الفيروس عبر الممرات التنفسية إلى الرئة. ثم أعد الفئران إلى أقفاصها وراقبها حتى تتعافى تماماً من التخدير. بعد ذلك، يتم جمع أنسجة الرئة من الفئران المحقونة لتحضير مستخلص خلوي لتقدير عيار الفيروس في أيام مختلفة بعد العدوى.

ضع الرئتين المستأصلتين من الفئران المضحى بها في أنابيب معقمة ذات غطاء لولبي سعة 1.5 milliliter تحتوي على 500 microliters من حبيبات الزركونيا والسيليكا بحجم 1.0 millimeter على الثلج. في حال عدم الانتقال إلى الخطوة التالية في اليوم نفسه، تُخزن العينات عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.

خلاف ذلك، أضف 1 mL من وسط DMEM الخالي من المصل البارد. ضع الأنبوب في جهاز تجانس العينات (bead beater) واضغط على زر البدء لتجانس الرئتين لمدة 30 ثانية، وذلك لتجنب ارتفاع درجة حرارة العينة التي قد تؤدي إلى تثبيط الفيروس.

برد الأنبوب على الثلج لمدة دقيقة واحدة على الأقل بعد عملية التجانس التي استغرقت 30 ثانية. ثم كرر هذه العملية. بعد ذلك، قم بطرد الأنسجة المتجانسة مركزياً بسرعة 16,000 RCF عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة دقيقة واحدة.

بعد عملية الطرد المركزي، ستترسب بقايا الخلايا في قاع الأنبوب وستتواجد الدهون على السطح. قم بسحب السائل الطافي (supernatant) فوراً كما هو موضح هنا لإجراء مقايسة اللويحات (plaque assay) باستخدام طبقة أحادية من خلايا NIH 3T3 أو BHK 21. بعد ذلك، يتم إجراء مقايسة اللويحات لتحديد العيار الفيروسي الموجود في العينة؛ ابدأ المقايسة بعمل تخفيفات تسلسلية للسائل الفيروسي الطافي.

أولاً، باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 270 µL من الوسط الغذائي إلى طبق معايرة ذو 96 بئراً، مع ترك الصف الأول فارغاً. ثم أضف 200 µL من السائل الطافي إلى الصف الأول من طبق المعايرة ذو الـ 96 بئراً، مع وضع كل عينة في ثلاث مكررات.

بعد ذلك، انقل 30 µL من العينة من الصف الأول إلى الصف التالي وامزجها. ثم انقل 30 µL من المزيج إلى الصف التالي وامزجه. كرر هذه الخطوة عدة مرات لإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف.

بعد ذلك، أضف الرائق الفيروسي المخفف فوق الطبقة أحادية الخلايا في طبق يحتوي على 24 بئراً. ضع الطبق في الحاضنة وقم بهز الطبق كل 30 دقيقة خلال فترة تحضين تستغرق ساعتين. بعد انتهاء التحضين، قم بشفط الرائق من الطبق لإزالة بقايا الخلايا.

بعد ذلك، اغسل الخلايا مرة واحدة بوسط غذائي جديد. وبعد الغسيل، أضف إلى الخلايا وسطاً غذائياً يحتوي على methylcellulose. حضّن الخلايا لمدة تتراوح بين أربعة إلى ستة أيام.

بعد مرور أربعة إلى ستة أيام، استخدم المجهر لقراءة عدد اللويحات في كل عينة. سجل عدد اللويحات لكل تخفيف.

بعد ذلك، احسب المتوسط والانحراف المعياري. لا يمكن استخدام الآبار التي تحتوي على عدد كبير جداً أو قليل جداً من اللويحات لحساب العيار بدقة. لذا، بالنسبة لكل عينة، استخدم تخفيفاً يتراوح فيه عدد اللويحات من 7 إلى 70 لويحة.

تحتوي هذه العينة المخففة بمقدار 1000 ضعف على متوسط 23 لويحة لكل بئر. ولحساب العيار الفيروسي في المحلول غير المخفف، اضرب عامل التخفيف في عدد اللويحات في عدد الميكرولترات الموجودة في المليلتر الواحد. ثم اقسم الناتج على حجم الطافي المخفف المضاف لكل بئر.

وبذلك في هذا المثال، 1000 مضروبة في 23 بقعة مضروبة في 1000 µL لكل مل مقسومة على 100 µL تساوي 2.3 × 10⁵ وحدة مكونة لكل مل. بعد ذلك، يُستخدم محلول مخزون فيروسي بمعاير معروف لتحديد حركية نمو gamma HV 68 في أرومات ليفية جنينية لفئران. نبدأ بتقسيم خلايا الفئران من النوع البري وتلك التي تفتقر إلى جين مضيف في طبق يحتوي على 24 بئراً بمعدل 10,000 خلية لكل بئر. وفي اليوم التالي، يتم استبدال الوسط في كل بئر بـ 0.5 mL من معلق gamma HV 68 بتعدد عدوى (MOI) منخفض.

ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية واترك عملية الحضن تستمر لمدة ساعتين طوال فترة الحضن. قم بهز الطبق كل 30 دقيقة بعد الحضن. استخدم ماصة لإزالة المعلق الفيروسي وأضف 0.5 milliliters من وسط DM EM كامل وطازج يحتوي على 8%fetal bovine serum إلى الخلايا المصابة بالفيروس.

أعد الخلايا إلى الحاضنة في أيام مختلفة بعد العدوى. اجمع الخلايا الموجودة في الوسط عن طريق السحب والضخ بالماصة لمرات متعددة. انقلها إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 milliliter ثم جمد الأنابيب فوراً عند درجة حرارة minus 80 °C لتحرير gamma HV 68 من الخلايا.

قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد والإذابة. قم بإذابة الخلايا عن طريق وضعها عند 37 °C، ثم استخدم جهاز الـ vortex وأعد وضعها في المجمد عند -80 °C.

يتم تحديد عيار الفيروس عن طريق مقايسة اللويحات باستخدام طبقة أحادية من خلايا NIH 3T3 أو BHK 21 كما هو موضح سابقاً، وذلك لفحص ما إذا كان تضاعف DNA أو RNA يتأثر بنقص في جينات المضيف أو الجينات الفيروسية. ابدأ باستخدام خلايا مصابة في أيام مختلفة بعد العدوى، وتخلص من السائل الطافي، واغسل الخلايا بـ PBS بارد ثم قم بهضم الخلايا باستخدام التربسين. بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 RCF في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة، وعقب عملية الدوران، تخلص من السائل الطافي وخزّن الخلايا عند درجة حرارة -80 °C.

استخلص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA) الكليين، واللذين يكونان من أصل مضيف وفيروسي. بعد ذلك، قم بطرد أعمدة الدوران مركزياً. أجْرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) باستخدام الـ DNA الكلي وبادئ متخصص للنساخ الفيروسية المحللة.

تحديد الكمية النسبية لجينوم gamma HV 68 داخل الخلايا بالنسبة لجين تدبير منزلي للمضيف مثل beta actin. تحضير CDNA باستخدام RNA الكلي وبادئ oligo DT. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) باستخدام CD NA والبادئات كما ذكر أعلاه لتحديد الكمية النسبية لنسخ الفيروس.

بالإشارة إلى الجين المرجعي للتدبير المنزلي في المضيف، فإن Mavs هو اختصار للإشارات المضادة للفيروسات في الميتوكوندريا كما هو موضح هنا. تقوم جزيئة Mavs الموائمة بنقل الإشارات من مستقبلات rig الشبيهة بالعين في العصارة الخلوية لتنشيط NF kappa B وعوامل تنظيم الإنترفيرون IRFs، والتي بدورها تعمل على زيادة التعبير الجيني للسيتوكينات المحرضة للالتهابات والإنترفيرونات. تظهر هنا الأحمال الفيروسية في رئة الفئران البرية المصابة بـ gamma HV والفئران من نفس البطن التي تعاني من نقص في Mavs.

أدى نقص Mavs إلى تقليل الأحمال الفيروسية بشكل ملحوظ في الرئة بعد 10 أيام من الإصابة، مما يشير إلى أن Mavs ضروري لحدوث عدوى فيروسية فعالة داخل الجسم (in vivo). يوضح هذا الشكل منحنى نمو فيروسي متعدد الخطوات على أرومات ليفية جنينية لفئران من النوع البري، وأخرى تعاني من نقص في Mavs. وقد لوحظ تأخر ملحوظ في النمو الفيروسي على الأرومات الليفية الجنينية للفئران، مما يشير إلى أن Mavs ضروري للتضاعف الفيروسي الفعال في المختبر (in vitro). تم تحليل مستويات mRNA للجينات الفيروسية الحالة في الأرومات الليفية الجنينية للفئران المصابة بـ gamma HV 68 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، وقد أدى نقص Mavs إلى تقليل مستويات mRNA لثلاثة جينات حالة أساسية بشكل ملحوظ.

تدعم كل هذه النتائج مجتمعة الاستنتاج بأن Mavs ضروري لتنشيط نسخ gamma HV 68 والتضاعف التحليلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استقصاء التفاعل بين المضيف والممرض على مستويات متعددة، في كل من VO و Vevo. لا تنسَ أن العمل مع الممرضات قد يكون محفوفاً بالمخاطر الشديدة.

يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية، أثناء تنفيذ الخطوات.