تعيش خلية من التصوير و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الخلايا الحية من خلال النمو والانقسام باستخدام الفحص المجهري الفلوري بحيث يمكن دراسة تأثير تاريخ الخلية والأصل على التطور الخلوي للبكتيريا. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا أولا من وسط سائل بتركيزات مغذية عالية نسبيا إلى وسط تجويع سائل. بعد ذلك ، شريحة مجهرية تنمو عليها الخلايا البكتيرية لتصبح مستعمرة صغيرة.

يتم إعداد أحادي الطبقة. ثم يتم تسجيل فيلم مجهري مضان بفاصل زمني. أخيرا ، تتم معالجة الفيلم وتحليل البيانات.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تطور خلية بكتيرية واحدة من خلال الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري القياسي ، هي أنها تسمح بمراقبة ديناميكيات البروتين والسلوك الخلوي وتطور الخلايا المفردة في الوقت المناسب ، مما يدل على أن الإجراء سيكون في المخروط ، طالب دكتوراه من مختبري لتحضير ب tuus تلقيح الخلايا من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، مخزون في 10 ملليلتر من الفحص المجهري بفاصل زمني أو وسط TLM في قوارير اهتزاز معقمة مكملة بالمضادات الحيوية إذا لزم الأمر ، تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة في قارورة اهتزاز معقمة في صباح اليوم التالي لنهب الخلايا من واحد إلى 10 في وسط Prewarm أو محدد كيميائيا أو CDM بدون مضادات حيوية ، وتنمية خلايا النحل الأكثر دقة إلى منتصف المرحلة الأسية ، الأمر الذي يستغرق حوالي أربع ساعات. قم بقياس امتصاص الثقافة عند 600 نانومتر وقم بتخفيف الخلايا إلى 600 تقريبا من 0.035.

استخدام آلية الإيداع النقدي النظيف. يضمن OD هذا رصد الخلايا المفردة ذات التباعد المناسب بين الخلايا على شريحة المجهر للفحص المجهري بفاصل زمني. قبل ساعة واحدة من وصول الخلايا إلى منتصف النمو الأسي.

قم بإعداد شريحة المجهر عن طريق تنظيف شريحتين زجاجيتين بنسبة 70٪ من الإيثانول والماء. قم بإزالة أحد الأغطية البلاستيكية من إطار الجينات ، مع الحرص على عدم التسبب في تفكيك الغطاء البلاستيكي على الجانب الآخر من الإطار. قم بإرفاق إطار الجين في منتصف إحدى الشرائح الزجاجية عن طريق لصقه أولا على جانب واحد ، ثم توجيه الباقي بأظافر.

استخدم الميكروويف لإذابة 150 ملليغرام من الصخور عالية الدقة والذوبان المنخفض. في 10 ملليلتر من آلية التنمية النظيفة ، تأكد من إذابة aros تماما لمنع تألق الخلفية. ماصة 500 ميكرولتر من آلية التنمية الزراعية الدافئة في منتصف إطار الجينات ، مع التأكد من تغطية المنطقة بأكملها بما في ذلك الحدود بالكامل.

العمل بسرعة لمنع الجفاف المفرط للعروق. ضع الشريحة الزجاجية الثانية على الإطار الجيني المملوء ب Aros CDM في محاولة لتجنب فقاعات الهواء. ضع الساندويتش في وضع أفقي عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة للسماح للزراعة بالتصلب بشكل كاف.

بمجرد أن تصلب الأروس بعناية ، انزلق من الزجاج العلوي. استخدم شفرة حلاقة لقطع شرائط زراعية يبلغ عرضها حوالي خمسة ملليمترات والتي ستنمو عليها البكتيريا. يمكن استخدام ثلاثة شرائط كحد أقصى لكل شريحة ، مفصولة بحوالي أربعة ملليمترات على كلا الجانبين.

ستوفر هذه المساحات الهواء الضروري لنمو Blu. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الثاني والأخير بعناية من إطار الجين لكشف الجانب اللاصق. قم بتحميل الخلايا المفردة في حوالي 2.5 ميكرولتر من السائل على الوسط الصلب ، بدءا من الجزء العلوي من وسادة agros دون لمسها.

باستخدام طرف الماصة، اترك الوسط ينتشر بالتساوي عن طريق إمالة الشريحة لأعلى ولأسفل. ضع غطاء مجهر نظيفا على إطار الجين لإرفاق زلة الغطاء بالكامل. استخدم ظفرها للضغط بعد تحميل الخلايا.

من الأهمية بمكان الانتظار حتى يجف السائل لفترة كافية حتى لا تحصل على خلايا السباحة والنمو في طبقات متعددة. ومع ذلك ، إذا تم تجفيف الخلايا لفترة طويلة جدا ، فستواجه مشاكل في النمو إلى طبقة أحادية صغيرة من الكولون. لذا فإن الوقت اللازم لتجفيف الشرائح يعتمد على التجربة ولا يمكن قياسه.

وبالتالي ، يحتاج المرء بالطبع إلى الشعور به لمنع مشاكل التركيز البؤري التلقائي خلال الساعات الأولى من تجربة الفاصل الزمني ، قم بتسخين الشريحة مسبقا لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية للتحضير للفحص المجهري بفاصل زمني. قم بتسخين الغرفة البيئية لمدة ساعتين على الأقل. قبل بدء التجربة ، حدد مرشحات الهدف المناسبة والمرآة ثنائية اللون وفقا لإعدادك التجريبي.

للتجارب الطويلة ، تأكد من وضع مرشح الأشعة فوق البنفسجية بين مصدر الضوء والعينة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا أمكن ، قم بحجب بعض ضوء الإثارة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة لتقليل التعرض. قم ببرمجة التجربة وفقا للإعداد التجريبي المحدد.

من الحكمة تحديد كمية الضوء المطلوبة لتركيبات محددة بالإضافة إلى إعدادات التركيز التلقائي للمجاهر أو البكتيريا الأخرى ذات الفاصل الزمني قبل التجربة الفعلية. ستقلل أوقات التعرض الأقصر والمستويات المنخفضة من ضوء الإثارة من التبييض والسمية الضوئية استخدم الضوء المسجل لوظيفة التركيز التلقائي. أخيرا ، ضع الشريحة المحضرة في الغرفة البيئية الدافئة للمجهر وراقب نمو الخلايا المفردة في طبقة أحادية المستعمرة الدقيقة عند 30 درجة مئوية.

ستنتج تجربة مضان الفاصل الزمني الناجحة طبقة أحادية المستعمرة الصغيرة تقع بالكامل في مجال الرؤية. في نهاية التجربة في هذا الفيلم ، يوجد مجال مشرق على اليسار ويمكن رؤية الفلورة. على اليمين.

فيما يلي مثال على مستعمرة B Subtles الدقيقة التي نمت فيها بعض الخلايا فوق بعضها البعض ، مما يجعل من الصعب تتبع تاريخها بدقة وكذلك قياس مستويات التألق بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد عينة مجهرية بنجاح للفحص المجهري بفاصل زمني وكيفية إجراء الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني. جرب خلايا BACE.