تعيش خلية من التصوير و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الخلايا الحية خلال مراحل النمو والانقسام باستخدام المجهر الفلوري، وذلك لدراسة تأثير تاريخ الخلية وأصلها على التطور الخلوي للبكتيريا. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق نقل الخلايا من وسط سائل يحتوي على تركيزات غذائية عالية نسبياً إلى وسط تجويع سائل. بعد ذلك، يتم تجهيز شريحة مجهرية لتنمو عليها الخلايا البكتيرية لتشكل مستعمرة مجهرية.

يتم تحضير الطبقة أحادية الخلية. بعد ذلك، يتم تسجيل مقطع فيديو باستخدام مجهر الفلورسنت بنظام التصوير المتقطع (time lapse). وفي النهاية، يتم معالجة الفيديو وتحليل البيانات.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر تطور خلية بكتيرية واحدة من خلال المجهر الفلوري بنظام التصوير الزمني (time-lapse fluorescence microscopy). تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الموجودة مثل قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) والمجهر القياسي، في أنها تسمح بمراقبة ديناميكيات البروتين، والسلوك الخلوي، وتطور الخلايا الفردية بمرور الوقت؛ سيتم توضيح الإجراء بواسطة cone، طالب دكتوراه من مختبري. لتحضير B. subtilis، يتم تلقيح الخلايا من مخزونات محفوظة عند -80 °C في 10 milliliters من وسط المجهر بنظام التصوير الزمني (TLM medium) في دوارق هزازة معقمة مضاف إليها المضادات الحيوية إذا لزم الأمر، وتُنمى الخلايا طوال الليل عند 30 °C وبسرعة 225 RPM في دورق هزاز معقم. وفي صباح اليوم التالي، تُخفف الخلايا بنسبة من 1 إلى 10 في وسط محدد كيميائياً (CDM) تم تدفئته مسبقاً وبدون مضادات حيوية، وتُنمى خلايا B. subtilis حتى تصل إلى طور النمو الأسي المتوسط، وهو ما يستغرق حوالي أربع ساعات. ثم يتم قياس امتصاص المزرعة عند 600 nanometers وتخفيف الخلايا لتصل قيمة a 600 إلى 0.035 تقريباً.

باستخدام وسط CDM. تضمن قيمة OD هذه أن يتم وضع خلايا مفردة بمسافات مناسبة بينها على شريحة المجهر من أجل التصوير المجهري المتقطع (time-lapse microscopy). يتم ذلك قبل ساعة واحدة من وصول الخلايا إلى مرحلة منتصف النمو الأسي.

قم بتحضير شريحة المجهر عن طريق تنظيف شريحتين زجاجيتين باستخدام 70%ethanol والماء. قم بإزالة أحد الأغطية البلاستيكية من إطار الجينات، مع الحرص على عدم التسبب في تفكك الغطاء البلاستيكي الموجود على الجانب الآخر من الإطار. قم بتثبيت إطار الجينات في منتصف إحدى الشرائح الزجاجية عن طريق لصقه أولاً من جانب واحد، ثم توجيه الجزء المتبقي باستخدام ظفر الإصبع.

استخدم الميكروويف لإذابة 150 milligrams من aros عالية الدقة ومنخفضة الانصهار. في 10 milliliters من CDM، تأكد من ذوبان aros تماماً لمنع حدوث الفلورة الخلفية. انقل بواسطة الماصة 500 µL من agro CDM الدافئ إلى منتصف إطار الجين، مع التأكد من تغطية المنطقة بأكملها بما في ذلك الحدود تغطية تامة.

اعمل بسرعة لمنع جفاف الـ aros بشكل مفرط. ضع الشريحة الزجاجية الثانية على إطار الجينات المملوء بـ Aros CDM مع محاولة تجنب فقاعات الهواء. ضع هذه "الساندوتش" في وضع أفقي عند درجة حرارة 4 °C لمدة 45 دقيقة للسماح للـ agros بالتصلب بشكل كافٍ.

بمجرد أن يتصلب الآجار، قم بإزالة الزجاج العلوي بعناية. استخدم شفرة حلاقة لقص شرائح آجار بعرض حوالي 5 mm، والتي ستنمو عليها البكتيريا. يمكن استخدام ثلاث شرائح كحد أقصى لكل شريحة زجاجية، بحيث تفصل بينها مسافات تبلغ حوالي 4 mm من كلا الجانبين.

ستوفر هذه المساحات الهواء الضروري لنمو Blu. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الثاني والأخير بعناية من إطار الجين لكشف الجانب اللاصق. قم بتحميل خلايا فردية في حوالي 2.5 µL من السائل على الوسط الصلب، بدءاً من أعلى لوحة agros دون لمسها.

باستخدام طرف الماصة، اسمح للوسط بالانتشار بالتساوي عن طريق إمالة الشريحة لأعلى ولأسفل. ضع غطاء المجهر النظيف على إطار الجين لتثبيت غطاء الشريحة تماماً. استخدم ظفراً لتطبيق الضغط بعد تحميل الخلايا.

من الضروري الانتظار حتى يجف السائل لفترة كافية لضمان عدم تحرك الخلايا بشكل عشوائي أو نموها في طبقات متعددة. ومع ذلك، إذا جففت الخلايا لفترة طويلة جداً، فستواجه مشاكل في النمو لتكوين طبقة أحادية من micro cholon. لذا، فإن الوقت المطلوب لتجفيف الشرائح يعتمد على التجربة ولا يمكن قياسه بدقة.

وبناءً على ذلك، يحتاج المرء بالطبع إلى اكتساب الخبرة العملية في هذا الأمر. ولمنع حدوث مشكلات في التركيز التلقائي (auto-focus) خلال الساعات الأولى من تجربة التصوير الزمني (time-lapse)، قم بتدفئة الشريحة مسبقاً لمدة ساعة واحدة عند 30 °C للتحضير للمجهر الزمني. قم بتدفئة غرفة البيئة مسبقاً لمدة ساعتين على الأقل. وقبل بدء التجربة، اختر العدسات الشيئية والمرشحات والمرآة ثنائية اللون (dichroic mirror) المناسبة وفقاً لإعدادات تجربتك.

بالنسبة للتجارب الطويلة، تأكد من وضع مرشح للأشعة فوق البنفسجية (UV filter) بين مصدر الضوء والعينة. بالإضافة إلى ذلك، قم بحجب جزء من ضوء الاستثارة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة إن أمكن لتقليل التعرض. قم ببرمجة التجربة وفقاً لإعدادات التجربة المحددة.

من الحكمة تحديد كمية الضوء المطلوبة لبنيات محددة، بالإضافة إلى إعدادات التركيز التلقائي لمجاهر التصوير الزمني الأخرى أو لأنواع بكتيرية أخرى قبل التجربة الفعلية. إن استخدام أزمنة تعريض أقصر ومستويات أدنى من ضوء الاستثارة سيقلل من التبييض والسمية الضوئية. استخدم الضوء المجهري لوظيفة التركيز التلقائي. وأخيراً، ضع الشريحة المُعدة في غرفة البيئة المسخنة مسبقاً بالمجهر، وراقب نمو الخلايا المفردة إلى طبقة أحادية من المستعمرات الدقيقة عند 30 °C.

سينتج عن تجربة الفلورة بنظام التصوير الزمني (time-lapse) الناجحة طبقة أحادية من المستعمرات الدقيقة تقع بالكامل ضمن مجال الرؤية. في نهاية التجربة الموضحة في هذا المقطع، يظهر الحقل المضيء (bright field) على اليسار، بينما تظهر الفلورة على اليمين.

إليك مثال لمستعمرة مجهرية من بكتيريا B Subtilis نمت فيها بعض الخلايا فوق بعضها البعض، مما جعل من الصعب تتبع تاريخها بدقة وكذلك قياس مستويات الفلورة الخاصة بها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير عينة مجهرية بنجاح للتصوير المجهري بنظام الفاصل الزمني وكيفية إجراء التصوير المجهري الفلوري بنظام الفاصل الزمني. تجربة باستخدام خلايا BACE.