تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية

الهدف العام من هذا الإعداد التجريبي للموائع الدقيقة هو تمكين المراقبة طويلة المدى للخلايا البكتيرية الفردية في ظل ظروف بيئية ثابتة وشديدة الخاضعة للرقابة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم وظائف الأعضاء البكتيري ، مثل أنماط الاستجابة طويلة المدى للخلايا الفردية للإجهاد أو كيف يختلف النمط الظاهري غير المتجانس عبر مجموعة سكانية بمرور الوقت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا مراقبة سلالات الخلايا الفردية لعشرات أو حتى مئات الأجيال ، في ظل ظروف بيئية ثابتة وموحدة وشديدة الخاضعة للرقابة.

بعد تحضير بوليمر PDMS وفقا لبروتوكول النص ، ضع سيد السيليكون على قطعة من رقائق الألومنيوم غير المنقطعة في طبق بتري من البوليسترين. يسكب خليط PDMS منزوع الغاز فوق السيد على عمق خمسة ملليمترات تقريبا. ثم قم بإزالة الطبق لمدة 10 دقائق على الأقل.

قم بمعالجة PDMS في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل وقم بتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة رقائق الألومنيوم التي تحتوي على السيد، وPDMS المعالج من اللوحة. قم بتسجيله بعناية وانزع رقائق الألومنيوم من الجزء الخلفي من السيد.

ثم قشر PDMS بعناية من السيد. كرقاقة ، عادة ما تتضمن العديد من أجهزة الموائع الدقيقة ذات الأبعاد المختلفة قليلا. استخدم مشرطا نظيفا وحادا لقص جهاز واحد بالحجم المناسب.

ضع قطعة من شريط المكتب الشفاف على الجانب المزخرف من الجهاز لتحسين رؤية الميزات المزخرفة. يتم تحديد منافذ المدخل والمخرج على أنها مناطق دائرية في طرفي نقيض من القنوات السائلة المرئية. اقلب جهاز PDMS مع وضع جانب النمط لأسفل واستخدم لكمة خزعة 0.75 ملم لكمة الجهاز إلى النقاط المحددة.

ثم تخلص من اللكمات. قد تكون هناك حاجة إلى ملاقط لإزالة اللكمات من الجهاز. أدخل زجاج الغطاء النظيف والمجفف وجهاز PDMS في منظف بلازما الأكسجين ومعالجة البلازما للجهاز بالإعدادات الموضحة هنا.

مباشرة بعد انتهاء العلاج بالبلازما ، قم بإزالة الجهاز وقم بتغطية الزجاج من منظف البلازما. اقلب نظام إدارة حماية البيانات وضعه في منتصف زجاج الغطاء بحيث يلامس جانب النمط الزجاج. تأكد من محاذاة قنوات التغذية مع الوصول الطويل لزجاج الغطاء.

اضغط لأسفل برفق شديد للتأكد من أن PDMS يغلق على الزجاج. اخبز الجهاز المجمع في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الخبز ، تحقق يدويا من ربط PDMS بالزجاج عن طريق الضغط برفق على أحد أركان الجهاز.

بعد قطع أنابيب البوليمر وفقا لبروتوكول النص ، قم بتجميع الوصلات Y لصمامات القرص ، في حالة استخدامها ، عن طريق قطع وربط أطوال سنتيمترين من أنابيب السيليكون المرنة بالأشواك العلوية ل Y وأطوال سنتيمتر واحد من أنابيب السيليكون إلى الشوكة السفلية ل Y.بعد ذلك ، قم بقص أطوال 10 سم من أنابيب البوليمر ثم قم بتوصيلها في أحد طرفيها بتقاطع التبديل عن طريق إدخالها في أجزاء أنابيب السيليكون التي يبلغ طولها سنتيمترا واحدا الشوكة السفلية من Y.قم بتوصيل أطوال الأنابيب في الطرف الآخر بإبر قياس 21 التي تمت إزالتها من محولات الحقن البلاستيكية الخاصة بها وثنيها حوالي 90 درجة على بعد حوالي تسعة ملليمترات من نهاية الإبرة. قم بتوصيل الإبر الحادة قياس 21 بأحد طرفي أجزاء الأنابيب التي ستمتد من المحاقن إلى جهاز التبديل عن طريق إدخال الإبر في الأنبوب. أدخل الأطراف الأخرى لكل طول من الأنابيب في أجزاء أنابيب السيليكون على أشواك مدخل التقاطعات Y.

بعد ملء المحاقن بوسط نمو البكتيريا ، المكملة ب BSA ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتوصيل المحاقن المحملة بالإبر المعدة عيار 21 ، وقم بتوصيلها بأنبوب المدخل وقم بتحميل المحاقن في مضخات الحقن. قم بتطهير الهواء من السباكة الداخلية عن طريق تشغيل مضخات الحقنة بمعدل تدفق مرتفع وتوجيه مضخات الحقنة عموديا ، والنقر على المحاقن لإحضار فقاعات الهواء إلى الأعلى. بمجرد تطهير الهواء من المحقنة ، ضع مضخة المحقنة أفقيا واضغط تدريجيا على خطوط البوليمر أو قم بنقرها من المحاقن ، لأعلى من خلال جهاز التبديل لإزاحة وتطهير أي فقاعات هواء.

كرر هذه العملية للبنك الثاني من المحاقن في حالة تبديل الوسائط. بعد تطهير فقاعات الهواء ، اضبط مضخة الحقنة في المرحلة الثانية على 1.5 ميكرولتر في الدقيقة ثم أوقف التدفق مؤقتا. ضع مشابك رابطة صغيرة على أجزاء الأنابيب المرنة على فرع التقاطعات Y المقابلة للمرحلة المتوسطة الثانية واستمر في تشغيل مضخة المرحلة الأولى لتطهير الوسط الثاني في اتجاه مجرى النهر من التقاطع Y.

لتحميل جهاز PDMS، ابدأ بوضع أطراف ماصة دقيقة فارغة ورفيعة تحمل الهلام برفق في فتحات مخرج جهاز الموائع الدقيقة. باستخدام أطراف رقيقة لتحميل الهلام مع الماصة الدقيقة P200 ، قم بتخميل الجهاز عن طريق حقن وسط يحتوي على ملليغرام واحد لكل مليلتر BSA في فتحات المدخل ، مع مراقبة الأطراف وفتحات المخرج لمراقبة ملء قنوات الموائع الدقيقة. احتضان الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تقريبا.

بعد ذلك ، باستخدام نصائح مماثلة ، قم بتحميل كل قناة بالخلايا المعاد تعليقها باستخدام النصائح الموجودة في قناة المخرج لمراقبة تقدم الخلايا عبر الجهاز. قم بإزالة أطراف تحميل الجل برفق من فتحات المخرج ، واعمل واحدة تلو الأخرى لمنع تلف الجهاز. الطرد المركزي الجهاز في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة في محول دوار مناسب عند حوالي 6 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق.

تحقق من التحميل الناجح تحت المجهر ولكن دون تثبيت الجهاز على ملحق مرحلة حامل الشريحة. قم بتركيب الجهاز المحمل بعناية على ملحق المسرح عن طريق لصق زجاج الغطاء على جانبي نظام إدارة المفاتيح الشخصية في الجزء السفلي من ملحق المرحلة. اقلب مجموعة جهاز إدخال المسرح بحيث يكون PDMS متجها لأعلى وضعه على سطح ناعم مثل منديل خال من الغبار.

اضبط معدل تدفق مضخة الحقنة في المرحلة الأولى إلى 35 ميكرولتر في الدقيقة. ثم العمل مع حارة واحدة في كل مرة ، أدخل إبرة المدخل ثم إبرة المخرج التي تمتد إلى دورق النفايات. بعد فحص الجهاز بصريا بحثا عن التسريبات ، افحص أنبوب المخرج بحثا عن ظهور الخلايا الزائدة التي تظهر على شكل شريط عكر في الغضروف المفصلي المتوسط ، والذي سيتحرك ببطء نحو دورق النفايات.

بمجرد تشغيل الجهاز لمدة 15 دقيقة تقريبا ، اضبط مضخة الحقنة من المرحلة الأولى على 1.5 ميكرولتر في الدقيقة وأوقف التدفق مؤقتا. قم بإحضار المضخة والجهاز بالكامل إلى مجهر الفلورسنت المقلوب وأعد تشغيل التدفق المتوسط للمرحلة الأولى بمعدل 1.5 ميكرولتر في الدقيقة. قم بتركيب ملحق المسرح بعناية مع وضع الجهاز على المجهر ، باستخدام الشريط اللاصق حسب الضرورة لتوجيه أنبوب المدخل والمخرج.

حدد المواضع المناسبة على الجهاز للتصوير وابدأ التصوير حسب الرغبة. لاحظ أن الخلايا تتطلب عادة بضع ساعات لقراءة الحالة المستقرة ، ونمو الطور الأسي ، وقد يتأخر بداية الحصول على الصورة حسب الرغبة بحيث يبدأ التصوير بعد فترة التوازن. للتبديل بين الجولات المتتالية من التصوير ، أوقف تدفق مضخة الحقنة من المرحلة الأولى مؤقتا ، وقم بفك مقاطع الموثق بعناية من أنابيب السيليكون في المرحلة الثانية ، ونقل كل منها إلى أنبوب السيليكون على فرع المرحلة الأولى من التقاطع Y ، ثم قم بإلغاء إيقاف تدفق مضخة الحقنة من المرحلة الثانية واستمر في التصوير.

كما تم تقييمه بواسطة الفحص المجهري للتباين الطوري ، قبل ربط السباكة الدقيقة بالجهاز ، يعتبر التحميل الأولي للخلية ناجحا إذا احتوت جميع القنوات الجانبية للموائع الدقيقة أو جميعها تقريبا على خلية بكتيرية واحدة أو أكثر. بمجرد تحميل الجهاز في البداية ، يتم موازنته بمعدل تدفق مرتفع نسبيا. كما هو موضح هنا ، يجب أن يكشف الفحص المجهري لجهاز متوازن عن عدد قليل من الخلايا المحصورة في ملف واحد في معظم القنوات الجانبية.

بمجرد وضع جهاز متوازن على المجهر تحت التدفق بسرعة 1.5 ميكرولتر في الدقيقة عند 37 درجة مئوية ، ستستأنف الخلايا نمو الطور الأسي المنتظم والمستمر على مدار ساعتين تقريبا. يمكن تصوير الخلايا التي استأنفت نمو الطور الأسي بشكل موثوق باستخدام المجهر اللامع أو الفلوري لمدة 24 ساعة على الأقل. يؤدي إدخال مفتاح متوسط إلى توسيع نطاق التجارب التي يمكن إجراؤها ولكنه يزيد أيضا من تواتر أحداث موت الخلايا الكارثية من خلال وجود فقاعات هواء أو مجموعات خلايا عند المدخل التي يتم إزاحتها وتمر عبر قناة التغذية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس ساعات تقريبا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باستخدام هذا الإجراء ، مع مختلف مراسلي الفلورسنت والسلالات والظروف البيئية ، يمكن فحص مجموعة متنوعة من الظواهر الفسيولوجية ، بما في ذلك الأحداث النادرة جدا أو العابرة.