تسجيل متعددة الخلايا في السلوك Myxococcus زانثس الأغشية الحيوية باستخدام الزمن الفاصل بين Microcinematography

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير مقايسة تصوير مصغر رخيصة بفاصل زمني بدقة كافية لتوليد نتائج قابلة للتكرار والقياس الكمي. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام حشوات السيليكون غير المكلفة القابلة لإعادة الاستخدام لبناء لوحات وسائط agros أو شرائح المجهر. تم الحصول على النتائج التي تظهر أن مجمعات الصفائح هذه تظل رطبة وأكسجين بدرجة كافية لأكثر من أسبوع على مجموعة متنوعة من أنواع الوسائط وتركيزات الأجار.

بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن التصوير السينمائي الدقيق بفاصل زمني هو عملية بطيئة ، فإن استخدام ثمانية مجاهر غير مكلفة يساعد على تسريع الحصول على البيانات. مرحبا ، أنا ريان تايلور من مختبر الدكتور روي ويلش من قسم الأحياء بجامعة سيراكيوز. سنعرض لك اليوم إجراء لصنع أفلام بفاصل زمني للأغشية الحيوية البكتيرية في مختبرنا ، وسنستخدم هذا الإجراء لدراسة السلوك متعدد الخلايا للأغشية الحيوية ل MTIs.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، قم بقياس كثافة الخلايا لمزيج عشية وضحاها ثقافة Occus sanus باستخدام مقياس clut ، ونقل مليلتر واحد من المزرعة إلى 2.5 مل لغسل حبيبات أنبوب الطرد المركزي وإعادة تعليق البكتيريا في وسائط TPM كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب ، الماصة والدوامة لإعادة تعليق الحبيبات تماما ، الأمر الذي قد يستغرق بعض الوقت. بعد ذلك ، أضف 0.5 جرام من aros إلى 50 مل من TPM ، وهي وسائط الفحص.

أضف أيضا 0.5 جرام من aros إلى 50 مل من C-T-T-Y-E ، وهو الأوتوكلاف القرص المغذي للتعقيم. ثم حافظ على الوسائط عند 55 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي. أثناء إنشاء مقايسة التتبع.

تشرع مجمعات الألواح في بناء المجهر الزجاجي لمعقم اللهب الأول للقرص الغذائي. حرك وضع حشية مطاطية من السيليكون معقمة بسمك 0.5 ملم أعلى الشريحة. تنشأ الماصات حوالي 300 ميكرولتر من وسائط C TT YE في البئر الذي تم إنشاؤه بواسطة الحشية الموجودة على الشريحة.

يجب أن تقوم الوسائط C-T-T-Y-E بتكديس النيران وتعقيم شريحة أخرى ووضعها بزاوية أعلى وسائط C-T-T-Y-E AROS. يمنع ضبط الشريحة بزاوية تكوين الفقاعة. بمجرد وضع الشريحة في مكانها ، قم بملء المجمع مع مقاطع رابطة صغيرة واحدة على كل جانب.

ضع المركب المقطوع عند أربع درجات مئوية واترك الوسائط الزراعية C-T-T-Y-E بالضبط. يستغرق هذا عادة حوالي خمس دقائق. بمجرد ضبط الزراعة ، يمكن للمرء تحضير مجمعات الألواح المستخدمة في فحص التتبع.

ابدأ بإعداد الشرائح لبناء مجمعات الفحص. لكل لهب معقدة معقمة اثنين من شرائح المجهر الزجاجي. ضع حشية الأوتوكلاف أعلى إحدى الشرائح لتشكيل الجزء السفلي من الفحص.

يتم استخدام الشريحة الأخرى لتسطيح agros وكشريحة دعم. الجزء العلوي من الاختبار هو زلة غطاء. قم أولا بلف شريحة المجهر بشريط لاصق ، ثم قم بلف الغطاء الزجاجي لمعقم اللهب وضعه فوق الشريحة الملفوفة المعقمة.

حرك الشريحة الملفوفة لأعلى تدعم زلة الغطاء ، مما يمنعها من التشقق. ضع حشية الأوتوكلاف أعلى زلة الغطاء المعقمة باللهب باستخدام ملقط. اضغط لأسفل على الحشيات الموجودة في الشريحة السفلية وانزلاق الغطاء للتأكد من أنها تشكل ختما بالزجاج.

خلاف ذلك ، قد تجف الوسائط التي تصفيفها. ضع حشية الشريحة وتجميعات حشية انزلاق الغطاء جانبا مع الجوانب المعقمة من الآن فصاعدا العمل على مجمع واحد فقط في كل مرة لمنع الوسائط الزراعية من التصلب ، مما قد يؤدي إلى ضعف جودة الفيلم. ابدأ بوضع القرص الغذائي.

قم بإزالة مركب القرص الغذائي من أربع درجات مئوية. قم بإزالة كسوف الربط والجزء السابق من الشرائح التي تعرض C-T-T-Y-E الصلبة الآن باستخدام ماصة أخذ العينات الدقيقة بطرف زجاجي سعة 100 ميكرولتر يمكن التخلص منه. قم بإزالة قرص مغذي بقطر ملليمتر واحد من وسائط C-T-T-Y-E agro أيضا وضعه في البئر الذي تم إنشاؤه بواسطة الحشية على زلة الغطاء.

ثم استرجع وسائط TPM agros من الحاضنة والماصة 300 ميكرولتر في البئر الذي تم إنشاؤه بواسطة الحشية الموجودة على زلة الغطاء وتحتوي على القرص الغذائي. يجب أن تتراكم وسائط TPM Agros لتسطيح وسط T-P-M-S-A ضع إحدى الشرائح المعقمة باللهب بدون حشية بزاوية أعلى وسائط TPM. يساعد وضع الشريحة بزاوية على منع تكوين الفقاعات.

قم بتثبيت المجمع مع مشابك رابطة صغيرة واحدة على كل جانب. ضع المركب المقطوع عند أربع درجات مئوية واترك الوسائط التي نشأت تتماسك. يستغرق هذا عادة حوالي خمس دقائق.

بمجرد ظهور الوسائط ، قم بإزالة المركب من أربع درجات مئوية. قم بإزالة مقاطع الموثق واضغط على نهاية المجمع. لفك الشريحة الملفوفة بالشريط ، قم بإزالة الشريحة الملفوفة بالشريط وضعها على المقعد لمزيد من الاستخدام.

ثم باستخدام زوج من الملقط كإسفين. افصل مجمع وسائط حشية انزلاق الغطاء عن شريحة الدعم وتخلص من شريحة الدعم. لا تستخدم حركة التحديق لفصل مجمع حشية انزلاق الغطاء لأن هذا قد يؤدي إلى فرملة انزلاق الغطاء أو التصاق الوسائط بشريحة الدعم.

بعد إزالة شريحة الدعم ، ضع مجمع وسائط حشية زلة الغطاء على الشريحة الملفوفة بالشريط مع وضع جانب الحشية لأعلى. ضع هذا المركب بجوار الموقد للسماح لكل الرطوبة المرئية بالتبخر من سطح الوسائط المكشوفة حديثا. لا تدع الوسائط تجف لمدة تزيد عن دقيقة واحدة.

نظرا لأن هذا قد يؤثر على سلوك سرب M Zant ، فانتقل إلى صفيحة الخلايا على مجمع الفحص المعد حديثا. بمجرد أن تتبخر الرطوبة الزائدة من وسائط حشية زلة الغطاء ، يستنشق مجمع agros 0.5 ميكرولتر من الخلايا المركزة لترسبها على الوسائط. يضغط Aeros على طرف الماصة قبل الاقتراب من وسائل الإعلام agros.

تظهر قطرة من الخلايا في الجزء السفلي من طرف الماصة ، مما يسهل ترسيب الخلايا دون أن يلمس الطرف الوسائط agros. يمكن أن يؤدي الاكتئاب على سطح agros إلى تغيير سلوك mz السرب. حرك الماصة لأسفل مباشرة لتوزيع الخلايا على بعد ملليمتر واحد تقريبا من القرص المغذي المدمج.

ثم اسحب الماصة لأعلى بشكل مستقيم. بهذه الطريقة ، يضمن المرء أن يكون السرب دائريا. بمجرد ترسيب الخلايا ، ضع المركب بجوار الموقد للسماح للخلايا بالجفاف لمدة لا تزيد عن 20 ثانية.

بعد التجفيف ، قم بمحاذاة مجموعة حشية الشريحة التي تشكل الجزء السفلي من المجمع مع الحشية الموجودة على الغطاء. حشية الانزلاق وسائط acro cell معقدة تشكل الجزء العلوي من المجمع. اضغط معا برفق لتشكيل ختم.

نظف أسطح الشريحة في زلة الغطاء بمنديل كيم لإزالة أي بقايا لمنع التكثيف. ضع المركب على مرحلة المجهر الساخن مباشرة بعد تنظيف الشرائح مع الانزلاق لأسفل وانزلاق الغطاء. إذا تشكل التكثيف ، فقم بترك مجمع الشرائح يجلس على المسرح المسخن لعدة ثوان قبل بدء تشغيل برنامج الحصول على الصور.

من أجل إعداد الفيلم ، اختر الهدف المناسب ، اثنان × أربعة × أو 10 × على المجهر. قم بتشغيل الكاميرا والمجهر وتحقق من مستويات الضوء للتأكد من أن الضوء ليس شديدا جدا. ابدأ تشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج الحصول على الصور.

انقر فوق نافذة الصورة الحية وركز على المجهر. تبدو الصورة مشابهة لتلك الموضحة هنا. ابدأ في الحصول على الصور.

تأكد من التحقق من التركيز بانتظام خلال الساعة الأولى حيث يميل أجار الوسائط إلى الاستقرار مما يتسبب في انحراف التركيز. بمجرد اكتمال الحصول على الصور ، انقل الصور المكتسبة للتخزين. قم بتفكيك مركب الشرائح عن طريق نقع 90٪ من الإيثانول طوال الليل أو TOLA الحشيات لإعادة الاستخدام.

يظهر فيلم الفاصل الزمني هذا أنهم يخضعون لمقايسة التتبع الموصوفة هنا. معدل الالتقاط هو صورة واحدة في الدقيقة بتكبير 20 × معدل تشغيل 60 صورة في الثانية. يعرض فيلم الفاصل الزمني هذا مجموعة من الخلايا حيث تعبر 1٪ من الخلايا عن GFP.

تم تجميع الفيلم عن طريق دمج تباين الطور المتناوب وصور الفلورسنت. تم إجراء الفحص على C-T-T-Y-E بمعدل التقاط 1٪ Aros هو صورة واحدة في الدقيقة كتكبير 100 x. يظهر هذا الفيلم بفاصل زمني الحركة الانزلاقية ل M Anthes.

تم إجراء هذا الاختبار على C-T-T-Y-E بنسبة 1٪ معدل التقاط Aros هو صورة واحدة في الدقيقة بتكبير 100 ×. يظهر فيلم TimeLapse هذا حركة الوخز P OSA. تم إجراء هذا الاختبار على LB في معدل التقاط 1٪ Aros هو صورة واحدة في الدقيقة.

عند تكبير 20 × معدل التشغيل هو 60 صورة في الثانية. يظهر فيلم الفاصل الزمني هذا أن سمار يستشعر حركة الاحتشاد. تم إجراء هذا الاختبار على LB ومعدل التقاط Aris 1٪ هو صورة واحدة في الدقيقة.

عند تكبير 20 × معدل التشغيل هو 60 صورة في الثانية. يظهر فيلم الفاصل الزمني هذا حركة انزلاق EGT. تم إجراء هذا الاختبار على LB بنسبة 0.5٪ معدل التقاط وردة العلامة هو صورة واحدة في الدقيقة حيث أن معدل التكبير 20 × معدل التشغيل هو 120 صورة في الثانية بسبب هشاشة 0.5٪ نشأت في lv.

هذا الاختبار استخدام الحشيات الأكبر حجما التي تظهر في الشكل الأول ب ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إنشاء أفلام بفاصل زمني للأغشية الحيوية البكتيرية. عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر أن تأخذ وقتك وأن تكون دقيقا قدر الإمكان لتحقيق نتائج متسقة.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.