Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص الالتقاط البكتيري بواسطة خلايا M الموجودة ضمن الجهاز المناعي للمخاطية المعوية. تتمثل الخطوة الأولى من هذا الإجراء في كشف وربط بقع باير المعوية لفأر تحت التخدير. بعد ذلك، يتم حقن بكتيريا فلورية في المنطقة المربوطة.

بعد ساعة واحدة، يتم استئصال رقع الـ pyres. ثم يتم نفاذ الخلايا في النسيج وصبغها للكشف عن الواسم الخاص بالخلايا M، وهو GP2. وأخيراً، يتم فحص العينات باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope)، حيث يمكن رؤية البكتيريا التي تخضع لعملية النقل الخلوي (transcytosis) بواسطة الخلايا M.

بالإضافة إلى تقديم رؤية حول الأساس الجزيئي للنقل عبر الخلايا البكتيرية بواسطة خلايا M، يمكن تطبيق هذا النهج على أنظمة أخرى. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا البروتوكول للمساعدة في تقييم نفاذية الخلايا وفي الأمعاء الملتهبة باستخدام الكوليرا والميكروبات. باستخدام ناشر زجاجي معقم، قم بتخطيط البكتيريا الفلورية على طبق آغار LB وحضن الطبق عند 37 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات مفردة. اختر مستعمرة واحدة من الآغار الصلب وقم بتلقيحها في 2 مل من وسط LB الطازج.

ثم يتم استزراع البكتيريا في جهاز هزاز طوال الليل عند 37 °C. وبمجرد نمو المزرعة البادئة، انقل 500 µL من البكتيريا إلى 4.5 mL من وسط LB، وحضن هذه المزرعة الجديدة عند 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات أو حتى تصل كثافتها الضوئية عند 600 nm إلى 1، مما يشير إلى أن النمو البكتيري في طور النمو اللوغاريتمي. عند هذه النقطة، قم بطرد المزرعة مركزياً عند 3000 ×g لمدة خمس دقائق عند 4 °C لحصد البكتيريا؛ وبعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي واغسل الراسب بـ 5 mL من محلول PBS المعقم. وبعد تكرار خطوة الغسيل، أعد تعليق البكتيريا في 5 mL من محلول PBS.

بعد وضع الفأر تحت تخدير مستمر بـ isof fluorine، استخدم أدوات معقمة لفتح بطن الفأر بطريقة معقمة. ابدأ بكشف الأمعاء الدقيقة وحدد مواقع رقع PI. بمجرد العثور على رقع PI، استخدم خيط خياطة معقم لربط الأمعاء على بُعد حوالي خمسة مليمترات من أحد جانبي الرقعة.

احرص على تجنب قطع الأوعية الدموية أثناء الإجراء. وبمجرد ربط الأمعاء، استخدم حقنة لحقن 50 µL من المعلق البكتيري بتركيز 10⁷ CFU في الحلقة المربوطة من رقعة pyres على الجانب غير المربوط من الأمعاء. ثم استخدم خيطًا لربط الجانب الآخر من الأمعاء.

أغلق بطن الفأر باستخدام مشبك وحافظ على تخدير الفأر لمدة ساعة واحدة قبل القتل الرحيم. ولحصد رقعة "بايرز" (pyres patch)، استأصل رقعة "بايرز" بعناية. ثم قم بغسل PBS بقوة عبر المقطع المحصود من الأمعاء عدة مرات لغسل الجانب القمي لرقعة PI وإزالة السوائل المخاطية والبكتيريا الزائدة.

بمجرد غسل رقعة PI، ضعها في بئر من طبق يحتوي على 24 بئراً وأضف محلول cyto effects أو cyto perm. يتم تحضين العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة. وبمجرد تثبيت رقعة P'S، انقعها في 1 mL من محلول perm wash buffer لمدة خمس دقائق.

كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. ثم ضع العينة في 1 mL من محلول الحجب (blocking buffer) واحضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد خطوة الحجب، أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة anti mouse GP2 بتركيز نهائي قدره 5 µg/mL واحضن العينة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C لصبغ خلايا M.

بعد ذلك، اغسل العينة كما سبق. أضف طبقة ثانوية من الأجسام المضادة المقترنة وحضن العينة على الثلج في الظلام لمدة ساعتين. وبمجرد صبغ العينة، اغسل العينة برفق في PBS.

بعد ذلك، ضع ثلاث أو أربع قطع من غطاء الزجاج الدائري على شريحة، واغمر رقعة pires في 200 µL من محلول glycerol بتركيز 30% في PBS. استخدم على الشريحة مجهر DM IRE two confocal laser أو مجهر Delta vision restoration deconvolution لفحص العينة. في هذه الصورة، يمكن رؤية بكتيريا salmonella typhimurium الموسومة بـ GFP باللون الأخضر وهي محاطة بـ GP two الموضح باللون الأحمر على الغشاء البلازمي القمي.

في هذه الصورة المدوّرة، تظهر البكتيريا داخل الحويصلات السيتوبلازمية تحت القمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم النقل عبر الخلايا البكتيري بواسطة خلايا M باستخدام مقايسة Lu المعوية المربوطة.