Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

الخلايا M في ظهارة جريب المرتبطة المتخصصة التي تغطي بقع باير لتلعب دورا هاما لالترصد المناعي المخاطي في الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية. نحن هنا وصف طريقة لتقييم من قبل خلايا جرثومية transcytosis M

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص امتصاص البكتيريا بواسطة الخلايا M الموجودة داخل الجهاز المناعي المخاطي للأمعاء. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في كشف وربط بقع الحرائق المعوية للفأر المخدر. ثم يتم حقن البكتيريا الفلورية في المنطقة المربوطة.

بعد ساعة ، يتم استئصال بقع الحداق. ثم تتخلل الخلايا الموجودة في الأنسجة وتلطيخها لعلامة الخلية M ، GP الثاني. أخيرا ، لوحظت العينات باستخدام مجهر متحد البؤر ويمكن تصور البكتيريا التي يتم نقلها بواسطة الخلايا الم.

بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة على الأساس الجزيئي لانتقال التخلية البكتيرية بواسطة الخلايا m ، يمكن تطبيق الفصل على نظام آخر. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للمساعدة في نفاذية الخلية وفي الأمعاء المؤطرة باستخدام الكلور والميكروب باستخدام موزع زجاجي معقم ، قم بربط البكتيريا الفلورية على لوحة مثقاب LB واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات مفردة. اختر مستعمرة واحدة من المثقاب الصلب وقم بتلقيحها في ملليلترين من وسائط LB الطازجة.

ثم استزراع البكتيريا على شاكر طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بمجرد نمو ثقافة البداية ، انقل 500 ميكرولتر من البكتيريا إلى 4.5 مل من وسط LB واحتضان هذه الثقافة الجديدة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات أو حتى تصل كثافتها البصرية عند 600 نانومتر إلى واحدة تشير إلى أن نمو البكتيريا في مرحلة اللوغاريتم. في هذه المرحلة ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 3000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لحصاد البكتيريا بعد الطرد المركزي ، وتخلص من snat واغسل الحبيبات بخمسة ملليلتر من PBS المعقم بعد تكرار خطوة الغسيل ، قم بتعليق البكتيريا في خمسة ملليلتر من PBS.

بعد وضع الماوس تحت التخدير المستمر للفلور ، استخدم أدوات معقمة لفتح بطن الفأر بشكل معجن. ابدأ بتعريض الأمعاء الدقيقة وحدد موقع بقع PI. بمجرد العثور على بقع PI ، استخدم خيوط خياطة معقمة لربط الأمعاء بحوالي خمسة ملليمترات إلى جانب واحد من الرقعة.

احرص على تجنب قطع الأوعية الدموية أثناء العملية. بمجرد ربط الأمعاء ، استخدم حقنة لحقن 50 ميكرولتر من المعلق البكتيري حوالي 10 إلى سبعة CFU في حلقة تصحيح المدافئ المربوطة على الجانب الفضفاض من الأمعاء. ثم استخدم الغزل لربط الجانب الآخر من الأمعاء.

أغلق بطن الفأر بمشبك وحافظ على الفأر تحت التخدير لمدة ساعة قبل القتل الرحيم. لحصاد رقعة المحرق ، قم باستئصال رقعة المحارب بعناية. ثم قم بغسل PBS بقوة من خلال الجزء المحصود من الأمعاء عدة مرات لغسل الجانب القمي من رقعة PI وإزالة السائل المخاطي الزائد والبكتيريا.

بمجرد غسل رقعة PI ، ضعها في بئر من 24 بئر وأضف تأثيرات cyto أو محلول cyto perm. احتضان العينة على الجليد لمدة ساعة واحدة. بمجرد إصلاح رقعة P'S ، انقعها في ملليلتر واحد من محلول غسيل التجعيد لمدة خمس دقائق.

كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. ثم ضع العينة في مليلتر واحد من المخزن المؤقت المانع واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد خطوة الحجب ، أضف جسمين مضادين أحادي النسيلة المضادين للفأر GP إلى التركيز النهائي البالغ خمسة ميكروغرام لكل مليلتر واحتضان العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية لتلطيخ الخلايا M.

بعد ذلك ، اغسل العينة كما كان من قبل. أضف أرضية ثانوية للجسم المضاد المترافق واحتضان العينة على الجليد في الظلام لمدة ساعتين. بمجرد تلطيخ العينة ، اغسل العينة برفق في PBS.

ثم ضع ثلاث أو أربع قطع من زجاج الغطاء الدائري على شريحة وقم بتضمين رقعة البيريس في 200 ميكرولتر من محلول الجلسرين بنسبة 30٪ في PBS. على الشريحة ، استخدم مجهر ليزر DM IRE ثنائي البؤر ، أو مجهر إزالة الالتفاف لاستعادة رؤية دلتا لمراقبة العينة. في هذه الصورة ، يمكن رؤية GFP الأخضر المسمى السالمونيلا التيفيموريوم محاطة ب GP اثنين موضحين باللون الأحمر على غشاء البلازما القمي.

في هذه الصورة المستديرة ، تظهر البكتيريا داخل الحويصلات السيتوبلازمية شبه القمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم التجميل الخلوي البكتيري بواسطة الخلايا M باستخدام Lu asay.