تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تجربة مصفوفة دقيقة للحمض النووي الريبي الصغير. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على شرائح المصفوفات الدقيقة المطبوعة التي تحتوي على مكتبة من مجسات الحمض النووي الريبي الدقيقة وإعداد عينات الحمض النووي الريبي بجودة وكمية مناسبة. بعد ذلك ، يتم تصنيف عينة الحمض النووي الريبي والحمض النووي المتحكم فيه بأصباغ الفلورسنت.

ثم تتم إضافة الأحماض النووية المسماة إلى شريحة المصفوفة الدقيقة للتهجين. أخيرا ، يتم غسل شريحة المصفوفة الدقيقة ومسحها ضوئيا ويتم تجديد الشريحة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التعبير الواسع عن الجينوم ل microRNAs من خلال تحليل الشريحة لشدة التهجين لمجسات الحمض النووي الريبي الدقيقة الفردية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التعبير الجيني ، مثل كيفية تأثير الظروف الفسيولوجية الطبيعية أو الظروف المرضية التفاضلية على التعبير عن الاحتياجات الدقيقة على نطاق عالمي. تعد جودة تصنيع المصفوفات الدقيقة أحد أهم العوامل لنجاح تجربة المصفوفات الدقيقة. بعد عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة تحافظ على الحمض النووي الريبي الصغير وتعليقه بتركيز يساوي أو يزيد عن ملليغرامين لكل مليلتر ، قم بتسمية الحمض النووي الريبي بحجم تفاعل 20 ميكرولتر عن طريق خلط حوالي 25 ميكروغراما من إجمالي الحمض النووي الريبي أولا مع 0.5 ميكروغرام من خمسة أولي P-C-U-D-Y 5 4 7 3 أولي في واحد X HEPs عازلة مكملة ب T four RNA Ligase 1D TT ، و TP. إذا كان الحمض النووي الريبي متاحا أقل ، فقم بتقليل كمية الحمض النووي الريبي والتفاعل.

إذا كان الحمض النووي الريبي مخففا جدا ، أضف حاملا مثل الخميرة ، TRNA للمساعدة في هطول الأمطار ، واحتضان التفاعل على الجليد داخل الثلاجة لمدة ساعتين إلى 24 ساعة. بعد ذلك ، أضف أسيتات الصوديوم إلى 0.3 مولار ، ثم ثلاثة أحجام من الإيثانول وقم بترسيب الحمض النووي الريبي طوال الليل عند سالب 20 درجة مئوية. لاستخدام الشرائح لأول مرة ، قم بتهجينها مسبقا في محلول مفلتر من ثلاثة XSSC و 0.1٪ SDS و 0.2٪ BSA لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغمر الشرائح في الماء عدة مرات. ثم في الأيزوبروبانول ، جفف الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي مع محول منزلق عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند 22 درجة مئوية. اشطف شرائط الرفع بالماء.

ثم في الإيثانول قبل التجفيف في الهواء ، ضع شريحة داخل قاعدة غرفة تهجين المصفوفة الدقيقة وانزلاق رافع أعلى الشريحة بحيث يغطي انزلاق الرافع منطقة المسبار وشرائطه البيضاء. اتصل بالشريحة في الظلام ، وقم بتدوير الحمض النووي الريبي المترسب المسمى ، واغسله مرة واحدة باستخدام 70٪ من الإيثانول وجفف الحبيبات في الهواء. يجب أن تكون الحبيبات حمراء اللون.

قم بإعداد محلول تهجين باستخدام واحد من 15 إلى واحد 100 في الحجم من الحمض النووي المرجعي المنقى المسمى لكل عينة من الحمض النووي الريبي قم بإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي تماما بحوالي 60 ميكرولتر من محلول التهجين لضمان عدم جفاف محلول التهجين. أثناء الحضانة ، أضف 20 ميكرولترا من الماء إلى كل من آبار الترطيب. في قاعدة غرفة التهجين microarray الصغيرة.

أضف مزيجا من الحمض النووي الريبي المسمى والحمض النووي المرجعي إلى الشريحة. باستخدام طرف ماصة رفيع، المس برفق حافة انزلاق الرافع ومن خلال الشفط. اسمح للمحلول بالدخول إلى الفراغ بين انزلاق الرافع والانزلاق.

ضع غطاء غرفة التهجين فوق القاعدة. ثم أغلق الغرفة بمشابك معدنية. ضع الغرفة بأكملها داخل الكيس البلاستيكي المرفق مع كاسيت الغرفة.

أخيرا ، ضع كاسيت الغرفة داخل وعاء بمنشفة ورقية مبللة. ثم قم بتغطية الحاوية بغلاف بلاستيكي وضعها داخل حاضنة زراعة الخلايا الرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تقريبا. لمعالجة الشرائح بعد التهجين ، قم بتفكيك أشرطة الغرفة واحدة تلو الأخرى ، وغمر شريحة ، وانزلق رافعها في اثنين من XSSC عند 22 درجة مئوية.

سوف تسقط زلة الرافع بشكل طبيعي من الشريحة ، وتغسل الشرائح في 0.8 XSSC مرتين ، ثم ثلاث مرات في 0.4 XSSC لمدة دقيقة إلى دقيقتين. جفف الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي مع محول منزلق. بعد ذلك ، قم بمسح الشرائح باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفة الدقيقة واستخدم برنامجا مثل الصمامات الزرقاء لتحديد الشدة في ملفات الصور.

افحص البقع الفردية لاستبعاد البقع غير الطبيعية التي تنشأ عادة من طباعة شرائح المسام أو معالجة الشرائح بعد التهجين. لتحليل البيانات وعرضها ، استخدم برامج مثل gene springing و excel لإعادة استخدام المصفوفة الدقيقة. قم بتجريد الشريحة عن طريق شطفها بالماء ، ثم غمرها في طبق تلطيخ من التدفئة المسبقة بمقدار واحد مللي مولار NAOH و 0.1 XSSC عند 62 درجة مئوية لمدة 10 إلى 20 دقيقة.

كرر الحضانة مرة ثانية. اغسل الشرائح عدة مرات في الماء لمدة تصل إلى 60 دقيقة مع رج برفق عند 22 درجة مئوية. جفف الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي وقم بتخزينها على حرارة 22 درجة مئوية.

يمكن استخدام الشرائح بدون تهجين مسبق. يوضح هذا الشكل صورة ممسوحة ضوئيا لمصفوفة دقيقة توضح إشارات تهجين دقيقة وقوية للغاية. نتجت البقع الحمراء عن تهجين البقع الخضراء للحمض النووي المرجعي من عينة الحمض النووي الريبي المسمى DY 5 47 ، وكانت البقع الصفراء من تهجين كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى نفس المجسات.

معاملات ارتباط بيرسون بين التكرارات التقنية لتهجين المصفوفات الدقيقة حوالي 0.99 مما يشير إلى قابلية استنساخ ممتازة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة الأشعة الدقيقة المخصصة ، ليس فقط لتحديد كمية الميكروناز ، ولكن أيضا لتحديد أنواع أخرى من الحمض النووي مثل mRNAs.