ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بكفاءة وبتكلفة زهيدة وبالحد الأدنى من المواد الأولية من خلال الجمع بين R-T-P-C-R الكمي المتعدد مع منصة الموائع الدقيقة. يبدأ هذا بتركيز الحمض النووي الريبي المستخرج ، متبوعا بالنسخ العكسي متعدد الإرسال والتضخيم المسبق المتعدد. الخطوة التالية هي تنقية البرايمر المفرط.

أخيرا ، يتم تحديد تعبير الحمض النووي الريبي الصغير أحادي الإرسال باستخدام منصة ميكروفيليديك. والنتيجة هي مستويات تعبير الحمض النووي الريبي الجزئي الدقيقة الدقيقة والقابلة للتكرار بدرجة كبيرة عبر العينات ذات الأهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية هي أن خطوة التنقية الإضافية بعد تضخيم ما قبل الكهرومغناطيسية تعمل على تحسين دقة وقابلية تكرار طريقة Q-R-T-P-C-R المتعددة.

ابدأ بالحمض النووي الريبي الذي تم استخراجه من المصل. باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي أو طريقة الحمض النووي الريبي القائمة على كلوروفورم الفينول من الأنسجة المتجانسة مثل الثلاث ، يجب اتباع جميع عمليات الاستخراج بخطوة غسيل ويتم كل التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تركيز محلول الحمض النووي الريبي.

إذا بدأت بكمية محدودة من العينة، مثل المصل أولا، فأدخل خزان عينة MicroCon في قارورة، ثم أدخل محلول الحمض النووي الريبي في الخزان، مع الحرص الشديد على عدم لمس الغشاء بطرف الماصة. الآن ضع القارورة والفلتر في جهاز الطرد المركزي مع شريط الكراك باتجاه الدوار وقم بتشغيل الطرد المركزي لمدة ثلاث ساعات تقريبا. بعد ثلاث ساعات ، سيتركز الحمض النووي الريبي بالكامل على الغشاء لتصفية الحمض النووي الريبي.

أضف الكمية المرغوبة من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي إلى الغشاء ، واقلب الخزان وضعه في قارورة جديدة. ثم يدور لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية بحد أقصى 3000 مرة G.Store الحمض النووي الريبي المركز عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة بعد إجراء تفاعل RT على الحمض النووي الريبي باستخدام بادئات حلقة الجذعية العكسية xpl ، متبوعة ب 12 إلى 18 جولة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم تمثيل microRNAs بواسطة خيوط CD NA.

وهذا ما يسمى منتج ما قبل PCR. بالإشارة إلى اللجنة القطرية لشؤون اللاجئين القادمة. يحتاج منتج ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تنقية هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ جنبا إلى جنب مع سلم DNA مقترن ب 10 قواعد تحميل كل حارة ب 5.5 ميكرولتر من ستة × برتقالية G جنبا إلى جنب مع 27.5 ميكرولتر من منتج PCR المسبق.

قم بتشغيل الجل بجهد 150 فولت لمدة 55 إلى 60 دقيقة. يعمل Romo phenol blue على هذا الجل في منطقة 20 زوجا أساسيا. بعد تشغيل الجل ، قم بتلطيخه بالذهب الإلكتروني لمدة 25 دقيقة ، دون تعريضه للضوء وعلى شاكر من الجل الملون.

اقطع نطاق منتج PCR المسبق من 60 إلى 80 زوجا أساسيا وانقل كتلة الجل إلى الأنابيب المصنفة. إذا كان تركيز المنتج منخفضا ، فقد لا يكون مرئيا ، لكنه سيظل في الجل. الآن سحق شريط الجل باستخدام أنبوب في أنبوب الطرد المركزي وإضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت TEN.

احتضان مزيج الجل العازلة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية مع التحريض. بعد أربع ساعات ، انقل السائل إلى أنبوب جديد وأضف 300 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت TEN. احتضن هذا المزيج بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع التحريض.

في اليوم التالي ، انقل محتويات الأنبوب مرة أخرى واستمر في ترسيب الإيثانول لمنتج ما قبل PCR. عندما يتم فتح شريحة من عبوتها ، يجب تحضيرها في غضون 24 ساعة ثم تحميلها في غضون 60 دقيقة من التحضير. ابدأ في تحضير المصفوفة عن طريق حقن 150 ميكرولترا من سائل خط التحكم في كل من المراكم الموجودة على الشريحة.

احرص على عدم انسكاب أي سائل على الرقاقة أو المداخل ، وإلا ستصبح الشريحة غير صالحة للاستعمال. ثم ضع الشريحة في الدائرة السائلة المتكاملة أو وحدة التحكم IFC وقم بتشغيل البرنامج النصي لتحضير وحدة التحكم. بمجرد بدء البرنامج ، ابدأ في تحضير العينات.

ابدأ بإعداد عينة pres امزج مزيجا من رجل التثبيت ، والمزيج الرئيسي العالمي ، وكواشف التحميل. ثم باستخدام تنسيق تحميل البئر 96 ، اجمع بين 2.25 ميكرولتر من كل عينة مع 2.75 ميكرولتر من مزيج العينة المسبقة لجمع السائل المحمل. دوامة لفترة وجيزة وبسرعة الطرد المركزي للوحة عند أربع درجات مئوية.

تم الآن إعداد لوحة العينة. استخدم الآن لوحا جديدا من 96 جيدا لتحضير تركيزات 13 × من خليط الفحص. يتم ذلك عن طريق خلط برايمر عالمي واحد ، وبرايمر أمامي ومسبار tac man خاص بالجين لكل بئر.

تركيزات X هي ميكرومولار واحد للتمهيدي العالمي والأمامي و 0.2 ميكرومولار لمسبار الرجل التاكسي. ثم أضف ما يكفي من المراهقين للتركيز النهائي 0.25٪ في حجم البئر النهائي البالغ خمسة ميكرولترات. تخلط جيدا مع تجنب الفقاعات وتدوير اللوحة لفترة وجيزة لتجميع السائل.

هذه هي لوحة الفحص. ابدأ البطاقة 96.96 Q-R-T-P-C-R عن طريق تحميل الشريحة. قم أولا بتحميل العينات ثم المقايسات بالحجم النهائي البالغ خمسة ميكرولتر لكل مدخل إلى مؤسسة التمويل الدولية.

ثانيا ، قم بتشغيل البرنامج النصي لمزيج التحميل لتحميل العينات والمقايسات في الشريحة. عند انتهاء البرنامج النصي ، قم بتقشير الفيلم الواقي من الرقاقة المحملة وإزالة أي جزيئات غبار أو حطام من سطح الرقاقة باستخدام شريط لاصق. الآن قم بإعداد برنامج تضخيم النظام الحيوي.

قم بتحميل الشريحة في النظام وقم بتشغيل البرنامج. يمكن تحليل النتائج باستخدام برنامج دايم السوائل لتوفير منحنيات التضخيم والخرائط الحرارية للرقاقة الكاملة وقيم التصوير المقطعي المحوسب لكل منها. حسنا باستخدام منتجات ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، المنقاة عن طريق فصل الحجم على المواد الهلامية الأصلية بولي أكريلاميد ، النوع البري DG CR ثمانية و ER مطفرة فارغة.

تم تحضير الحمض النووي الريبي مقارنة بالبروتوكولات السابقة. يحدث المزيد من الحمض النووي الريبي الصغير وفقدان الإشارات الإيجابية الكاذبة في كل من الخلفيات الفارغة الثمانية والصفراء الفارغة من DGCR بفضل خطوة التنقية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نهج QR TPCR R المعدل بالتصنيف الصحيح للربات الحمضية الصغيرة النادرة D gcr ثمانية مستقلة تعتمد على التقطيع.

هنا ، تم فحص 48 cera من المرضى والضوابط لتغيير التعبير عن 384 microRNAs مختلفة. تم تطبيع البيانات لكل عينة عن طريق طرح الوسيط المقابل ودون استخدام ارتفاع في الضوابط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تعدد الإرسال Q-R-T-P-C-R على منصة خط الإنفلونزا لتوصيف مئات الميكروناز في وقت واحد عبر العديد من العينات ، حتى عند البدء بمدخلات محدودة للغاية ، الحمض النووي الريبي.