الأمر الذي أدى إلى انسداد النسخ المتماثل الموقع المحدد في E. القولونية استخدام نظام نيون كاظمة المشغل

الهدف العام من هذه التجربة هو إيقاف شوكة النسخ المتماثل في كتلة البروتين النووي ومراقبة هياكل الحمض النووي في موقع الكتلة لغرض دراسة مسارات إصلاح الحمض النووي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تكرار الحمض النووي وإصلاحه ، مثل كيفية معالجة الحمض النووي عندما يواجه جهاز النسخ المتماثل للخلية حاجزا في طريق البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا إيقاف شوكة النسخ المتماثل بشكل عكسي في موقع محدد على الكروموسوم عبر مجموعة كاملة من الخلايا الحية.

سيظهر هذا الإجراء الأعضاء التالية أسماؤهم في مختبري ، الدكتورة كارلا متريك ، وطالبة الدراسات العليا ، جورجيا ويفر ، وتايلا آن كوروتشر. يتم استخدام سلالة الإشريكية القولونية التي تحمل مصفوفة مشغل التتراسيكلين في بلازميد pKM1 لهذا الإجراء. يقوم pKM1 بتشفير TetR-YFP ، وهو بروتين مثبط التتراسيكلين الأصفر المحفز الذي يحمل علامة بروتين الفلورسنت.

بتخفيف ثقافة جديدة بين عشية وضحاها لسلالة الإشريكية القولونية هذه إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.01 في وسط معقد مخفف بالمضادات الحيوية كما هو مطلوب للاختيار. قم بزراعة المزرعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.05 إلى 0.1. قم بإزالة عينة 10 مليلتر لتكون بمثابة عنصر تحكم غير مستحث.

أضف 0.01٪ أرابينوز إلى المزرعة المتبقية للحث على إنتاج TetR-YFP من pKM1. استمر في زراعة كل من الثقافات غير المستحثة والمستحثة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز. بعد ساعة واحدة ، تحقق من وجود نقطة محورية واحدة داخل كل خلية من المزرعة المستحثة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

إذا تم تأكيد حظر الخلايا المستحثة ، ويشار إليها بأكثر من 70٪ من الخلايا التي لها تركيز واحد ، فقم بتسجيل الكثافة البصرية وإزالة 7.5 مل من العينة لتحليلها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. قم بإزالة عينة مكافئة من ثقافة التحكم غير المستحثة. قبل الفحص المجهري الفلوري ، قم بإعداد وسادات الاغاروز لمنع حركة الخلايا أثناء التصور.

لكل وسادة الاغاروز ، قم بوضع 500 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر على شريحة مجهرية وقم بتراكب الغطاء مباشرة قبل أن تصلب الاغاروز. قم بتخزين الشرائح بين الأنسجة المبللة عند أربع درجات مئوية لحين الحاجة. عندما يحين وقت فحص الخلايا ، قم بإزالة الغطاء من وسادة الاغاروز وماصة 10 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية في وسط الوسادة.

بعد حوالي خمس دقائق ، عندما تجف وسادة الاغاروز ، استبدل الغطاء. ضع قطرة من زيت الغاطس على الغطاء وضع الشريحة تحت البصريات. تصور الخلايا باستخدام الفحص المجهري الطوري بتكبير 100x.

في مربع الحوار Acquire داخل برنامج التصوير، قم بتعيين Exposure Time إلى 100 مللي ثانية. حدد اكتساب لالتقاط الصورة. لا تحرك المسرح.

في مربع الحوار Acquisition، حدد YFP كإضاءة للغالق الخارجي المرتبط بالكاميرا. اضبط وقت التعريض الضوئي على 1,000 مللي ثانية. قم بإيقاف تشغيل ضوء المسرح وحدد Acquire لالتقاط الصورة الفلورية.

لبدء هذا الإجراء ، أضف أزيد الصوديوم إلى عينات المزرعة التي تم جمعها مسبقا إلى تركيز نهائي قدره 0.1٪ واحتضانه على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. الطرد المركزي للخلايا في 5 ، 000 مرة جم لمدة عشر دقائق. تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق كل حبيبات خلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت PIV وانقل الخلايا إلى أنبوب ميكروفوج. أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لتكسير الخلايا والتخلص من المادة الطافية. عالج شريحة المجهر ب 40 ميكرولترا من محلول زجاجي مناسب طارد للماء أو محلول سيليكون.

افركي الشريحة بمنديل حتى تجف. أعد تعليق الخلايا ذات أقل كثافة خلوية في 50 ميكرولتر من PIV وضعها عند 50 درجة مئوية في كتلة حرارية. بالنسبة لجميع العينات الأخرى ، اضبط أحجام PIV بحيث تكون كثافة الخلية النهائية هي نفسها في كل أنبوب.

أضف حجما متساويا من محلول الاغاروز الطازج 0.8٪ في PIV إلى العينات. احتفظ بالعينات في الكتلة الحرارية للتأكد من أنها أعلى من 50 درجة مئوية لمنع التصلب. ضع 20 قطرة ميكرولتر من معلق الخلية الاغاروز على الشريحة المعالجة لإنتاج سدادات نصف كروية.

عندما تصلب المقابس ، حرك جميع المقابس برفق من عينة واحدة إلى أنبوب ميكروفيج واحد وأضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت لتحلل الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، قم بإزالة المخزن المؤقت لتحلل الخلية وأضف 1 مليلتر من محلول EDTA-Sarkosyl-Proteinase K أو ESP.

احتضن عند 50 درجة مئوية طوال الليل أو حتى تصبح المقابس شفافة. بمجرد أن تصبح المقابس شفافة ، قم بإزالة المخزن المؤقت ESP وانقل المقابس إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 12 مل من المخزن المؤقت TE واتركه لمدة 30 دقيقة.

اغسل المقابس ما مجموعه خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت TE. قم بتخزين المقابس عند أربع درجات مئوية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت TE. لتحليل المواد الوسيطة للنسخ المتماثل ، يتم هضم الحمض النووي الموجود في سدادات الاغاروز بإنزيم تقييد مناسب للمنطقة ذات الاهتمام.

في هذا المثال، يقوم EcoRV بقطع الحمض النووي مباشرة قبل المصفوفة، وداخل المصفوفة، وبعد المصفوفة، لإعطاء شظايا 5.5 كيلو بايت و6.7 كيلو بايت في منطقة الاهتمام. لبدء هذا الإجراء ، انقل سدادة الاغاروز إلى أنبوب ميكروفوجي جديد وأضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإنزيم التقييد. أضف 25 إلى 100 وحدة من إنزيم التقييد وهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات.

تحضير جل الاغاروز 0.4٪ عند أربع درجات مئوية. صب 300 مل من الاغاروز المنصهر في صينية هلام بحجم 25 × 25 سم تقريبا. أدخل مشطا لجعل الآبار بنفس عرض قطر القابس تقريبا.

عندما يتم ضبط الجل ، قم بإزالة المشط وانقل الجل إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام حلقة التلقيح ، حرك أحد سدادات الاغاروز المهضومة في بئر ، ووضع الجانب المسطح من القابس على جانب البئر حيث سيدخل الحمض النووي إلى الجل. أدخل قابسا واحدا بنفس الطريقة في كل بئر ثانية.

الماصة المنصهرة 0.4٪ agarose في الآبار لإغلاق المقابس في موضعها. قم بتحميل سلم الحمض النووي بحجم كيلو بايت واحد في بئر فارغ ، مع ترك فجوة بين السلم والعينات. قم بتشغيل الجل طوال الليل في 1xTBE في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي ، قم بتلطيخ الجل في حمام مائي يحتوي على 0.3 ميكروغرام لكل مليلتر من بروميد الإيثيديوم لمدة 20 دقيقة. تخيل الحمض النووي باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الموجة وقم بقص كل جزء من الممر بقطع مستقيم متساو يقلل من إدراج الاغاروز الزائد على جانبي الممر. ضع ممر الجل المستأصل في صينية هلامية عند 90 درجة في اتجاه هجرة الحمض النووي.

الخطوة التالية هي تحضير 300 مل من الاغاروز لهلام البعد الثاني. عندما يتم تبريد الاغاروز إلى 50 درجة مئوية ، قم بتقطيع الماصة المنصهرة حول شرائح الهلام لترسيخ موضعها. صب ما تبقى من الاغاروز في الصينية إلى عمق لا يقل عن شرائح الجل.

بمجرد أن يتم ترسيخ الجل ، قم بالكهرباء في 1xTBE يحتوي على 0.3 ميكروغرام لكل مليلتر من بروميد الإيثيديوم عند أربع درجات مئوية حتى يهاجر الحمض النووي حوالي 10 سم. استئصال الكتل التي يوجد بها الحمض النووي الجيني بما في ذلك الجل فوقه ، لتشمل الحمض النووي غير المرئي. يتم تصور الحمض النووي داخل الجل لاحقا عن طريق التهجين الجنوبي كما هو موضح في بروتوكول النص.

في هذا النظام ، تم تأكيد كتلة النسخ المتماثل بواسطة غالبية الخلايا التي تحتوي على تركيز واحد يتوافق مع نسخة واحدة من المصفوفة داخل الخلية. أدت إضافة الأنهيدروتتراسيكلين إلى عكس الكتلة وتم تصور الازدواجية اللاحقة للمصفوفة على أنها تراكم الخلايا ذات البؤر المتعددة. أظهرت الخلايا ذات النسخ المتماثل المحظور أيضا تثبيط النمو الذي انعكس عن طريق النمو اللاحق في وجود الأنهيدروتتراسيكلين.

لتحليل وسيطات النسخ المتماثل ، تم تحليل الحمض النووي كهربائيا في البعد الأول. ثم تم استئصال الحمض النووي المثير للاهتمام وأدى الرحلان الكهربائي للبعد الثاني إلى قطر من الحمض النووي الخطي. كشف التهجين الجنوبي للحمض النووي للمصفوفة عن بقعتين في العينة غير المحجوبة تتوافق مع شظايا 5.5 كيلو بايت و 6.7 كيلو بايت المتوقعة من المصفوفة.

أظهرت العينة المحظورة انخفاضا في بقعة 5.5 كيلو بايت وإضافة إشارة بيضاوية تشير إلى تراكم الحمض النووي على شكل حرف Y. أدت إضافة الهيدروتراتيسيكلين إلى القضاء على إشارة الحمض النووي على شكل حرف Y. وسيط شائع آخر هو تقاطع هوليداي الذي يتم تصوره كإشارة مخروطية في الجزء العلوي من القوس Y وارتفاع من الحمض النووي الخطي في نهاية القوس Y.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثمانية أيام إذا تم تشكيلها بشكل صحيح. في حين أن إجراء ثنائي الأبعاد ، من المهم أن تتذكر أن جودة سدادات الحمض النووي أمر بالغ الأهمية للتصور الأمثل لهياكل الحمض النووي.