تقييم الخلية الجذعية السرطانية الهجرة عن طريق أجهزة ميكروفلويديك Compartmentalizing والتصوير لايف الخليوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص وتوصيف هجرة الخلايا السرطانية بصريا من خلال جهاز موائع دقيقة مجزأة. يتم تحقيق ذلك عن طريق الفصل الأول للخلايا العصبية الموجودة مسبقا للخلايا الجذعية لورم الدماغ المزروعة في وسط خال من المصل. الخطوة الثانية هي تصنيع SU ثنائي الطبقات ثمانية سيد واستخدام قالب الطباعة الحجرية الناعم A-P-D-M-S الذي يتميز بتصميم مجزأ.

بعد ذلك ، قم بتجميع جهاز الموائع الدقيقة وتحميله بالخلايا الجذعية لورم الدماغ. أخيرا ، يتم إجراء التصوير بفاصل زمني طويل الأمد لهجرة الخلايا الجذعية لأورام الدماغ باستخدام نظام مجهري الكل في واحد. في النهاية ، تظهر النتائج أن الخلايا الجذعية لأورام الدماغ تظهر تسلسلا دوارا من المراحل المورفولوجية أثناء هجرتها عبر الفضاء الضيق للغاية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الكتل الموجودة مثل Transwell Boyton Chamber ، هي أن الجهاز الصغير يسمح بالفحص البصري لعملية الهجرة ، ووضع الخلايا المتحكم فيه ، والتسليم الدقيق للعوامل. لذلك ، تتميز تقنية الفوريك الدقيقة بميزات الاختيار والملاحة الموثوقة والفعالة والفعالة من حيث التكلفة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج ورم خبيث للسرطان وتكراره لأن تحليل الخلية المفردة للخلايا عالية الارتحال قد يحدد أهداف العلاج الكيميائي المستقبلية المحتملة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسلوك الهجرة لنظام السرطان ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التطور الجنيني ، والاستجابات المناعية ، والتئام الجروح ، وتجديد الأعضاء. بدءا من تعليق الخلية من BTSC العصبية المشتقة من BTSC. قم بتجميع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بطردها بسرعة 900 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، ولكن ليس بشكل أسرع.

استنشق السوبر ناتين. ثم اسمح للمناطق العصبية بالارتخاء عن طريق احتضانها في 0.5 مل من Accutane الدافئ لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتعطيل الخلايا ميكانيكيا ب 10 إلى 20 ضربة لطيفة من ماصة P 100.

ثم أضف 1.5 مل من وسط الخلايا الجذعية لتحييد جهاز الطرد المركزي Accutane ، وتعليق الخلية عند 1300 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق الخلايا في مليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية. تحقق من كثافة الخلية باستخدام مقياس الخلوي الدموي واضبط الكثافة على 20،000 خلية لكل ميكرولتر. لبدء تصنيع SU ثمانية سيد ، قم بإعداد قناعين للصور باستخدام Adobe Illustrator وفيلم شفافية الطباعة بالليزر مع Image Setter مدمج.

يتكون قناع الصورة من الطبقة الأولى من علامتين إيمانية ومجموعة من القنوات الصغيرة ، والطبقة الثانية من قناع الصورة تحتوي على غرف الجلوس والاستقبال. نظف طبقتي القناع بالأيزوبروبانول واتركهما حتى يجفوا في الهواء. الآن قم بتدوير رقاقة مقبض بسمك ثلاثة ميكرون SU ثمانية مقاومة للصور ، متبوعة بالخبز الناعم.

ثم مع قناع الصورة من الطبقة الأولى في الأشعة فوق البنفسجية عن كثب ، قم بتعريض الصورة ، ومقاومة والسماح لها بالشفاء. ثم بعد الخبز وتطوير الرقاقة المقددة. قم بتغطية مناطق العلامة الإيمانية لرقاقة المقبض بشريط سكوتش.

ثم قم بتدوير الرقاقة بمقاومة صور بسمك 250 ميكرون. بعد ذلك ، انزع الشريط للكشف عن العلامات لغرض المحاذاة. ضع الطبقة الثانية من مقاومة الصور وقم بمحاذاة العلامات الإيمانية

ثم تكشف الأشعة فوق البنفسجية وتعالج قناع صور الطبقة الثانية متبوعا بالخبز والتطوير. الآن قم بتجهيز SU ثمانية سيد عن طريق ترسيب البخار لتقليل لزوجة السطح. ضع الرقائق في مجفف مع عدة قطرات من محلول Tri Chloro cline تحت الفراغ لمدة ساعة واحدة على الأقل.

سيكون السيد بعد ذلك جاهزا للاستخدام لتشكيل PDMS مع السيد. ابدأ بخلط قاعدة البوليمر المسبق جيدا مع المعالجة بنسبة 10 إلى واحد. ثم ضع المزيج في مادة مجففة لتفريغ الغاز بالفراغ حتى لا تظهر فقاعة هواء.

يسكب المزيج على القناع ويخرج مرة أخرى. إذا تم إدخال فقاعات هواء جديدة ، فقم بمعالجة القالب على صفيحة ساخنة مستوية لمدة ساعتين عند 90 درجة مئوية. بعد أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، حرر ختم PDMS برفق.

وبالتالي ، يتم نقش قنوات الاستزراع في PDMS وجاهزة لتجميع جهاز الموائع الدقيقة. يمكن إعادة استخدام السيد للقولبة حتى يتشقق أو يتآكل. عندما يصبح السيد لزجا ، يمكن إعادة تطبيق طلاء العصا المضادة.

ابدأ بعمل مداخل ومخارج في جهاز الموائع الدقيقة من خلال ختم PDMS. باستخدام ثقب ثقب الخزعة ، قم بتنظيف ختم PDMS عن طريق نقعه في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، ثم شطفه بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق. تعقيم واستكمال تفاعلات الوصلات المتقاطعة لختم PDMS من خلال التعقيم.

الآن ضع ختم PDMS على زلة غطاء زجاجي مطلية ب poly L lysine. ثم يتم طلاء الجهاز بالصفائح عن طريق ملء الغرف بمحلول مصفح من خلال مداخل الخزان واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، استنشق الرقائق من الجهاز.

ثم اغسل الجهاز عن طريق إغراقه مرتين بوسط الخلايا الجذعية. الآن قم بتحميل 11 ميكرولترا من الخلايا المنفصلة في أحد خزانات البذر إذا لزم الأمر ، استخدم الشفط الفراغي لإجبار الخلايا على الدخول إلى الغرفة. ثم قم بتحميل سبعة ميكرولترات إضافية من الخلايا في خزان الجلوس المجاور.

بعد خمس دقائق ، ستغمر خزانات المقاعد والاستقبال بالوسائط. الآن ضع ورقة PDMS معقمة بسمك 0.5 إلى ملليمتر واحد على الجهاز. سيؤدي التصاق السطح الطبيعي ل PDMS بنفسه إلى إغلاق الجهاز بمجرد إغلاقه ، وهو جاهز للنقل والحضانة والتصوير المجهري.

بتوازن البيوت مسبقا ، وقم بالمراسلة الفورية عن طريق تشغيله لمدة 45 دقيقة. لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة والرطوبة وإمدادات الهواء ، أضف عدة أطباق من الماء إلى غرفة العينة للحصول على الرطوبة المناسبة. قم بتحميل الجهاز المعد في غرفة عينة المجهر.

قم بتوسيط الجهاز باستخدام ملاقط صغيرة. الآن قم بتعيين نقاط موضع التركيز البؤري والنقاط الزمنية باستخدام برنامج Biot وابدأ تسجيلات الفاصل الزمني إذا لزم الأمر. بعد خمسة أيام في الثقافة ، استبدل وسائط الثقافة.

تم تسجيل BTCs المصنفة في الجهاز بشكل مستمر بواسطة صورة المرحلة. لمدة خمسة أيام في غرفة الجلوس ، بقيت الخلايا على شكل مغزل في مرحلة ما قبل الهجرة. عندما اقتربوا من مدخل القناة الدقيقة ، توسعت بعض الخلايا وولدت نتوءات لاصقة.

تمكنت زنزانة واحدة فقط من احتلال المدخل واستكشاف اتجاه الهجرة. بمجرد أن تحدد الخلية اتجاه الهجرة ، شرعت في الإبحار عبر القناة الدقيقة بأكملها بسرعة عالية ثابتة. في نهاية Microchannel ، شرعت الخلية في استكشاف المساحة المفتوحة لغرفة الاستقبال قبل دخولها أخيرا.

من خلال مراقبة الخلايا بفترتين ثانيتين للتصوير ، يبدو أن قوة الهجرة تتولد في الغالب عن طريق نشاط الثرثرة المشابه لنشاط خلايا OID. أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تصميم الجهاز مرن للغاية بحيث يمكن التلاعب بأبعاد القناة الدقيقة لتحقيق الدرجة المطلوبة من هجرة الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء جهاز موائع دقيقة فريد من نوعه مناسب لزراعة الخلايا التي تهمك ، ثم إجراء تصوير بفاصل زمني طويل المدى لتحديد الخصائص المهاجرة لهذه الخلايا نوعيا وكميا باتباع هذا الإجراء.

يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي أو المصفوفة الدقيقة للحمض النووي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مدى اختلاف الخلايا السرطانية عالية الارتحال وراثيا.