تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

مرحبا ، أنا كيفن فاز. أنا طالب ماجستير في الهندسة في مختبر السوائل الحيوية بجامعة كورنيل. واليوم سأتحدث عن استخدام جهاز ميكروفلويديك قائم على agros لدراسة تأثير عامل نمو البشرة EGF على الخلايا الجذعية العصبية لمورين.

يتكون الجهاز بشكل أساسي من ثلاث قنوات ميكروفلويديك ، عرض كل منها 150 ميكرون. يتم ضخ EGF في إحدى القنوات الجانبية ويتم ضخ المخزن المؤقت في القناة الجانبية الأخرى. إنه يقوم بشكل أساسي بإعداد تدرج كيميائي خطي ثابت عبر القناة المركزية.

نظرا لأن EGF المنتشر ينتشر بسهولة من خلال الهلام الزراعي ، يتم زرع الخلايا الجذعية العصبية في القناة المركزية ويتم مراقبة تقدم هجرتها من خلال المجهر. لذا فإن الأجهزة تتكون بشكل أساسي من طبقة علوية من زجاج شبكي تحتوي على جميع المداخل والمنافذ للتوصيل بالأنبوب. وتحته غشاء هلام زراعي ، يحتوي على أربعة أجهزة نمطية.

هذا محاط بفاصل PDMS ، مما يضمن أن لدينا سماكة ثابتة في جميع أنحاء الجهاز بشكل عام. يتجمع PDMS والهلام على شريحة زجاجية مطلية بإلخ. هذا يساعد الخلايا على الالتصاق بالشريحة الزجاجية.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام صفيحة الفولاذ المقاوم للصدأ لتركيب الجهاز بأكمله ونحن نعطير الجهاز مع البراغي. تم نقل خط الخلية من النوع البري بناقل الفيروس القهقري للتعبير عن مستقبلات EGF من النوع البري وتم نقل خط خلية دلتا بنسخة متحولة من مستقبلات EGF التي تمكنها من أن تكون نشطة بشكل أساسي بدون رابط EGF. حسنا ، سأبدأ بشرح عملية تجميع جهاز السائل الصغير الخاص بنا.

لذلك قمت أولا بوضع فاصل PDMS حول ميزات الإغاثة لقنوات السيليكون الصغيرة في أسيادنا. حتى الآن سأزن 0.3 جرام من agros. لذا سأحضر الآن 10 مليل من ثاني أكسيد الكربون2 الوسائط المستقلة وأضيفها إلى agros.

وسأقوم بسحب الأنابيب لأعلى ولأسفل لخلط مسحوق aros مع CO2 الوسائط المستقلة. الآن نحن جاهزون للميكروويف. كما ترون الآن ، أصبح الأغروس الآن سائلا ، ولكن لا يزال هناك عدد قليل من الحبيبات المتبقية.

سأحاول تدوير هذا لإذابة الحبيبات والتخلص من فقاعات الهواء. لذلك أقوم بصب agros المنصهر على ميزات الإغاثة الخاصة ب Silicon Master وسآخذ الآن شريحة زجاجية معقمة وأضعها فوق فاصل PDMS. ووضعتها بزاوية لمحاولة إجبار معظم فقاعات الهواء في الجل الزراعي على الخروج.

وقمت بالضغط وسأستمر في الضغط حتى تصلب قشرة agros. لذلك بعد دقيقة إلى دقيقتين تصمد. الآن سأقوم بإزالة الكمية الزائدة من الشريحة.

الخطوة التالية هي الانزلاق برفق من الشريحة الزجاجية ويمكن التخلص من هذه الشريحة الزجاجية. الآن سأحاول نقل النمط برفق إلى شريحة زجاجية قمت بتغطيتها مسبقا بالفبرونكتين. أستخدم هذه الورقة البلاستيكية المعقمة بشكل أساسي لمساعدتي في رفع النمط الزراعي باستخدام فاصل PDMM MS وسأقوم بنقل النمط agros مع القنوات لأسفل باتجاه الشريحة.

الآن بعد أن أصبح هذا ثابتا على الشريحة الزجاجية ، سأقوم بعمل ثقوب في الخزانات الفردية حتى يتمكن المشعب البلاستيكي من الوصول إلى القنوات. سأفعل ذلك باستخدام أداة ثقب معدنية صغيرة. الآن انتهينا من عمل ثقوب في الجهاز.

سأضيف 500 ميكرولتر من الوسائط المستقلة CO2 لمنع جفاف القنوات الصغيرة وسأتركها الآن لمدة دقيقة إلى دقيقتين. حسنا ، بعد دقيقة إلى دقيقتين ، سأحاول تصريف الوسائط الزائدة والآن سأقوم بمحاذاة الثقوب التي تم ثقبها في النمط الزراعي مع فتحات المدخل والمخرج لمشعب زجاج شبكي. وبمجرد محاذاة الثقوب ، أضغط بقوة لتشكيل ختم لطيف.

الآن أضع مشعب زجاج شبكي فوق حوامل الفولاذ المقاوم للصدأ والآن سأقوم بتجميع الجهاز برفق باستخدام البراغي. أنا حريص جدا على عدم الإفراط في إحكام ربط البراغي لأن هذا سيؤدي إلى سحق القنوات وأضع البراغي في اتجاه عقارب الساعة لمنع جل Agros من الداخل من الشق. سأقوم برسم ميل واحد من الوسائط وسأستخدم هذه المحقنة لاختبار الجهاز.

وكما ترون، أنا أقوم بحقن السوائل في كل قناة دقيقة وأبحث عن سائل يخرج من كل مخرج. لذا في الوقت الحالي ، قمت بوضع الجهاز المجمع في الغرفة البيئية للمجهر. يتم الحفاظ على هذا عند 37 درجة مئوية ، لذلك سيؤدي ذلك إلى تسخين الجهاز وتجهيزه عندما نحتاج إلى زرع الخلايا.

وكما ترون ، لقد قمت بالفعل بربط الاثنين ، أنابيب مضخة المظلة من خلال الإعداد. وأنا حاليا أقوم بتنظيف الأنبوب باستخدام PBS استعدادا لتجاربنا. حتى الآن سنقوم بإعداد الأنبوب.

سأقوم بربط أنبوب مضخة المظلة من خلال الأغطية مع ثقوب مثقوبة فيها بالفعل. ويحتوي كل أنبوب على عدد محدد من الشقوق لجعله قادرا على تحديد كل من مدخل ومخرج الأنبوب. لذا فإن الأنبوب الذي يحتوي على أربع شقوق سيتلقى 10 نانوجرام لكل مل.

سيقوم حل EGF الآن بإرفاق الأنبوب بالجهاز. لذلك سأقوم بتثبيته على كل جهاز وفقا لعدد الشقوق التي يحتوي عليها. لذلك فهو يتوافق مع الحل الذي يتخذه.

والآن أقوم بإرفاق أنبوب المخرج. نستخدم أنبوبا واضحا للتأكد من أن الوسائط تتدفق بالفعل عبر أنبوب المخرج ولا توجد عوائق في القناة. والآن سأبدأ مضخات المظلة.

لذا سأبدأ الآن إجراء زرع الخلايا في القناة المركزية. سأبدأ بإخراج الوسائط الزائدة في قناة المستشعر. لذا سأرى الآن الخلايا.

الخلايا معلقة بالفعل في CO2 وسائط مستقلة. وكنت أبيع ، كنت جالسا 60 في مدخل القناة المركزية وكنت جالسا 20 ميكرولترا في المخرج. ونأمل أن تجلس الخلايا بالتدفق المدفوع بالجاذبية.

وسأكرر هذا الإجراء للقناتين الحساستين الأخريين وسنلاحظ ذلك الآن تحت المجهر لمعرفة ما إذا كان جلوس الخلية ناجحا. حتى الآن التزمت الخلايا بالشريحة الزجاجية وفي غضون دقائق قليلة ستبدأ في الانتشار وتحقيق مورفولوجيتها الفريدة. لذلك قمنا اليوم بتغطية تجميع الجهاز الفعلي ، وإعداد الكواشف وتقنيات المجهر التي أستخدمها لتصوير هجرة الخلايا داخل الجهاز.

في الختام ، نأمل أن يكون لهذا الجهاز تنازل أوسع بكثير ، وتحديدا في البيئة السريرية. لذا ارسم واحدا أفقيا. يوضح مسارات خلايا C 17.2 وزيادة تركيزات EGF عموديا.

يوضح مسارات السلالات المختلفة لخلايا C 17.2 التي استخدمناها في تجاربنا بنفس تركيز EGF. تظهر بيانات الخلية الأبوية أن هناك ذروة في الحركة عند تدرج تركيز 10 نانوجرام لكل مل EGF ، مما يشير إلى أن المستقبلات أصبحت مشبعة بالترابط بتركيز أعلى من EGF. وتظهر بيانات النوع البري أن هناك زيادة في الحركة عند تركيز مائة نانوجرام لكل مل أو EGF.

يشير هذا إلى أن المستقبلات لا تصبح مشبعة بتركيزات أعلى من EGF. هذا منطقي لأنه تم تصميمه للإفراط في التعبير عن مستقبلات EGF. أخيرا ، تشير بيانات خط خلية دلتا إلى أن حركة الخلايا مستقلة تقريبا عن تركيز EGF.

هذا متوقع أيضا لأن مستقبلات EGF المتحولة تم تصميمها ليتم تنشيطها بشكل مستقل عن وجود EGF.