للدائرة للتخصيص لقياس الهجرة الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة بسيطة لدراسة تأثيرات العوامل الكيميائية والنبضة الكيميائية على هجرة الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تفاعل الخلية مثل تأثيرات عوامل النمو المختلفة على التئام الجروح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتخصيص بسهولة لتطبيقات مختلفة وسهلة الاستخدام للباحثين من جميع مستويات المهارة.

ستظهر الإجراء أنيكا تشودري ، طالبة جامعية ، وتايلر هارفي ، طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء ، قم بإنشاء ملف CAD بالشكل المطلوب للقناة الصغيرة. اضبط عرض القناة وطولها لتحقيق التدرج المطلوب.

هنا ، يتم توصيل مربعات 2.254 سم بقناة بعرض 0.127 سم. بعد ذلك ، احصل على قطعة من الأكريليك بالسمك المطلوب من أجل إنشاء العمق المناسب للقناة الدقيقة. يعتبر عرض لوح الأكريليك الذي يبلغ حوالي ستة عشر من البوصة مثاليا حيث يصعب قطع الألواح السميكة ويمكن أن تنكسر الألواح الرقيقة جدا أو تتشوه أثناء العملية.

قم باستيراد ملف CAD إلى جهاز القطع بالليزر وضع قطعة الأكريليك على سطح القطع. ثم اقطع الغرفة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضع قطعة الأكريليك المقطعة حديثا على شكل الحديد في طبق بتري صغير وقم بتغطيتها حتى الحاجة إليها.

في قارب الوزن ، أضف عشرة أجزاء من قاعدة المطاط الصناعي ، مع جزء واحد من عامل المعالجة وحرك باستخدام ماصة دقيقة لمدة خمس دقائق. انقل الخليط إلى غرفة مفرغة من الهواء ، واسحب المكنسة الكهربائية لمدة 30 دقيقة لإزالة أي فقاعات هواء محاصرة من PDMS. عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية وإزالة قارب الوزن.

صب PDMS منزوع الغاز فوق فتحة أكريليك على شكل حديد في طبق بتري صغير. تأكد من أن نظام إدارة الدعارة (PDMS) يغطي الملحق بالكامل. اسمح ل PDMS بالمعالجة لمدة 18 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بقص PDMS بعناية حول قطعة الأكريليك بمشرط وقم بإزالة الحشوة.

في خزانة زراعة الخلايا القياسية ، ضع غرفة القناة الدقيقة في طبق بتري ، وقم بتمييزها لأعلى وقم بتغطيتها بالكامل بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم أغلق غطاء المحرك وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بتعريض الغرفة للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة إلى ساعتين.

بعد التعرض ، افتح شفاط التدفق الرقائقي وانتظر 15 دقيقة حتى يعيد شفاط التدفق التدفق. بعد ذلك ، قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ وغسل الغرف مرتين باستخدام PBS المعقم. استخدم مليلتر واحد PBS لكل غسلة.

بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة PBS واترك الغرف تجف طوال الليل مع إغلاق الأغطية. احصد نوع الخلية المراد اختباره وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 400 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو واخلطها برفق. ضع 100 ميكرولتر من هذا المحلول على مقياس كثافة الدم عن طريق ملء كلتا الحجرتين برفق تحت زلة الغطاء الزجاجي.

استخدم مجهرا بهدف 10x للتركيز على الشبكة الموجودة على مقياس كثافة الدم. ثم استخدم عداد الإحصاء اليدوي لحساب الخلايا الحية غير المستمرة داخل جميع المجموعات الأربع المكونة من 16 مربعا على مقياس كثافة الدم. اقسم العدد الكلي للخلية على أربعة واضرب هذا الرقم في 50،000 للحصول على عدد الخلايا لكل مليلتر من معلق الخلية.

بناء على هذا الحساب ، أضف 2500 خلية و 100 ميكرولتر من الوسائط إلى بئر واحد في كل غرفة. اسمح للخلايا بالجلوس في الغرفة لمدة 60 دقيقة ثم أضف وسائط إضافية. للبدء ، أضف الاغاروز إلى الماء وقم بتسخين المحلول في الميكروويف لمدة دقيقة واحدة ، أو حتى يذوب الاغاروز تماما ويصبح المحلول صافيا.

اترك المحلول يبرد لمدة 15 إلى 30 ثانية قبل سكبه في طبق بتري. لإزالة أي فقاعات ، ضع طبق بتري في غرفة مفرغة واترك الاغاروز يتجمد أثناء الفراغ لمدة 30 دقيقة. بمجرد التصلب ، قم بقطع مكعب من الاغاروز بملليمترين في ملليمترين في ملليمترين بمشرط من طبق بتري.

اغمر المكعب تماما في محلول يحتوي على التركيز المطلوب لعامل التكتيك الكيميائي ، وانقع كتلة الاغاروز طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع كتلة الاغاروز التي تحتوي على عامل التكتيك الكيميائي في الطرف البعيد من غرفة القناة الدقيقة. استخدم علامة ، مثل ميكروبيدات البوليسترين أو عيب مجهري في الغرفة.

لتحديد موقع البداية النسبي للخلايا. استخدم برنامج التصوير لالتقاط صور منقضة الوقت لواجهة الخلية المتحركة كل ساعة لمدة 12 ساعة. توثق سلسلة الصور المعروضة هنا حركة جبهة الخلية عبر القناة استجابة لتدرج مصل الأبقار الجنيني الموجود في الطرف المقابل من القناة.

تم قياس مسافة الهجرة بناء على مسافة جبهة النمو من عيب مجهري في الجهاز. من هذه القياسات ، وجد أن متوسط سرعة واجهة الخلية هو 13.4 ميكرومتر في الساعة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات ، مع 18 ساعة إضافية من وقت الانتظار حتى يتم علاج PDMS ، و 12 ساعة إضافية للتصوير بفاصل زمني.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين من مستويات المهارة المختلفة ، بما في ذلك الطلاب الجامعيين الذين لديهم خبرة معملية قليلة لاستكشاف التئام الجروح وهجرة الخلايا بسهولة في المختبر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إزالة ملحق الأكريليك بعناية من قالب PDMS لضمان الإنتاج الناجح لغرفة القناة الدقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج غرفة قناة دقيقة بسيطة لدراسة هجرة الخلايا استجابة للإشارات الكيميائية المختلفة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن دراسة إشارات أخرى مثل التدرجات الكيميائية القابلة للذوبان المتعددة ، والركائز ، والسوائل الشفافة والمجالات الكهربائية من أجل دراسة تأثيرها على هجرة الخلايا. لا تنس أن العمل باستخدام قواطع الليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل الحصول على التدريب المناسب واستخدام معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.